用于检测维生素D代谢物的方法和系统技术方案

本文公开用于检测生物学样品中的至少两种维生素D代谢物的方法和试剂盒，其包括处理生物学样品以准备样品用于LC‑MS/MS分析，使准备的样品通过具有出口连接至串联质谱入口的液相色谱柱，从而分离所述两种维生素D代谢物(如果存在于样品中)，并将两种维生素D代谢物引入串联质谱。该方法还包括在所述串联质谱中产生两种维生素D代谢物各自的[M+H]

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于检测维生素D代谢物的方法和系统有关的美国申请本申请要求于2018年1月29日提交的美国临时申请No.62/623,445的优先权益处，通过援引将其全部内容并入本文。
本申请涉及维生素D代谢物的检测，和更特别地涉及用质谱检测维生素D代谢物的方法。
技术介绍
维生素D是必需营养素，在钙(Ca2+)稳态的正调节中具有重要生理学角色。维生素D能够通过暴露于日光在皮肤中新形成或能够从膳食吸收。存在两种形式的维生素D：维生素D2(麦角骨化醇)和维生素D3(胆钙化醇)。膳食和内在合成的维生素D3均必须发生代谢性活化才能产生生物学活性的代谢物。在人类中，维生素D3最初主要在肝中羟基化以形成25-羟基维生素D3(25-羟基胆钙化醇；骨化二醇；25OHD3)中间体代谢物，其是维生素D3在循环中的主要形式。循环中的25-羟基维生素D3然后通过肾转化为1,25-二羟基维生素D3(骨化三醇；1,25(OH).2D.3)，其一般据信是具有最高生物学活性的维生素D3代谢物。源自真菌和植物来源的维生素D2在人类中发生与维生素D3相似途径的代谢性活化，形成代谢物25-羟基维生素D2(25OHD2)和1,25-二羟基维生素D3(1,25(OH)2D2)。尽管维生素D(无活性的维生素D前体)的测量在临床情况下罕见且几乎不具诊断价值，但测量25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2(总25-羟基维生素D；"25OHD")的血清水平能够用于诊断和治理钙代谢障碍。尤其是，低水平25OHD指示维生素D缺乏，其与疾病比如低钙血症，低磷酸盐血症，继发性甲状旁腺功能亢进症，碱性磷酸酶升高，成人骨软化和儿童佝偻病有关。在怀疑维生素D中毒的患者中，升高水平的25OHD将该障碍区别于导致高钙血症的其它障碍。尽管测量1,25(OH)2D具有受限的诊断有用性，但是某些疾病比如肾衰竭能够通过降低水平的循环1,25(OH)2D进行诊断。此外，升高水平的1,25(OH)2D可以指示副甲状腺激素过多或者可以指示某些疾病比如肉瘤样病或某些类型的淋巴瘤。常规地，放射免疫测定已用来检测维生素D代谢物，其使用25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的共特异性抗体，于是不能区别25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2。质谱也已用于检测特定的维生素D代谢物。许多这些方法需要将代谢物衍生，但是还已知经由质谱检测维生素D的某些未衍生代谢物的方法。仍然需要用于在样品比如生物学样品中检测维生素D代谢物的改善的方法和系统。专利技术概要在一个方面，本公开提供通过质谱包括串联质谱检测维生素D代谢物在样品中存在或量的方法。优选，本专利技术方法不包括在质谱分析之前衍生维生素D代谢物。在下文讨论的实施方式中，与一种或多种有关维生素D代谢物的质子化分子离子及其有关的碎片离子例如不牵涉失水的碎片离子有关的MRM(多反应监测)转变能够用来检测维生素D代谢物在样品中的存在。在一个方面，公开在生物学样品中检测25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的方法，其包括处理样品以便准备样品用于引入串联质谱，在串联质谱的离子源中离子化经处理的样品以便产生25-羟基维生素D3(如果存在于样品中)的前体质子化离子，其质荷比为401.3±0.3，和产生25-羟基维生素D2(如果存在于样品中)的前体质子化离子，其质荷比为413.3±0.3，在所述串联质谱的第一阶段选择所述25-羟基维生素D3和所述25-羟基维生素D2的所述前体质子化离子。25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的至少一部分质子化分子离子能够在质谱的碎片化模块中碎片化以产生碎片离子。25-羟基维生素D3质子化分子离子的碎片化导致产生一种或多种碎片离子，其质荷比为257.2±0.3或其质荷比为121.1±0.3或其质荷比为133.1±0.3或其质荷比为147.1±0.3。此外，25-羟基维生素D2质子化离子的碎片化导致产生碎片离子，其质荷比为271.2±0.3或其质荷比为133.1±0.3或其质荷比为121.1±0.3或其质荷比为255.2±0.3。用串联质谱第二阶段中的质量分析仪选择与25-羟基维生素D3质子化分子离子碎片化有关的至少一种碎片离子和与25-羟基维生素D2质子化分子离子碎片化有关的至少一种碎片离子，并且检测以鉴定25-羟基维生素D3和/或25-羟基维生素D2在样品中的存在。在某些实施方式中，经处理的样品能够在串联质谱的离子源中离子化以便产生25-羟基维生素D3(如果存在于样品中)的前体质子化离子，其质荷比为401±0.3或质荷比为401.3±0.3或质荷比为401.6±0.3，并且产生25-羟基维生素D2(如果存在于样品中)的前体质子化离子，其质荷比为413±0.3或质荷比为413.3±0.3或质荷比为413.6±0.3。此外，25-羟基维生素D3质子化分子离子碎片化导致产生一种或多种碎片离子，其质荷比为257.2±0.3或质荷比为257±0.3或质荷比为257.5±0.3或质荷比为256.9±0.3或质荷比为121±0.3或质荷比为121.1±0.3或质荷比为121.4±0.3或质荷比为120.8±0.3或质荷比为133±0.3或质荷比为133.1±0.3或质荷比为133.4±0.3或质荷比为132.8±0.3或质荷比为147±0.3或质荷比为147.1±0.3或质荷比为147.4±0.3或质荷比为146.8±0.3。在某些实施方式中，25-羟基维生素D2的至少一部分所选质子化离子能够碎片化以产生至少一种碎片离子，其质荷比为120.8或质荷比为121±0.3或质荷比为121.1±0.3或质荷比为121.4±0.3或质荷比为132.8±0.3或质荷比为133±0.3或质荷比为133.1±0.3或质荷比为133.4±0.3或质荷比为270.9±0.3或质荷比为271±0.3或质荷比为271.2±0.3或质荷比为271.5±0.3或质荷比为254.9±0.3或质荷比为255±0.3或质荷比为255.2±0.3或质荷比为255.5±0.3。在某些实施方式中，方法能够还包括定量25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2在样品中的浓度。举例来说，在某些所述实施方式中，标准品比如氘化25-羟基维生素D3和/或氘化25-羟基维生素D2能够用来定量这些维生素D代谢物在样品中的量。举例来说，D6-25-羟基维生素D3能够用作标准品。在某些所述实施方式中，D6-25-羟基维生素D3离子化以产生质子化分子离子，其质荷比为407.3±0.3，并且该质子化分子离子碎片化以产生碎片离子，其质荷比为263.2±0.3或121.1±0.3或173.1±0.3或147.1±0.3。此外，在某些实施方式中，D6-25-羟基维生素D3能够离子化以产生质子化分子离子，其质荷比为407±0.3或质荷比为407.3±0.3或质荷比为407.6±0.3，并且该质子化分子离子碎片化以产生碎片离子，其质荷比为262.9±0.3或质荷比为263±0.3或质荷比为263.2±0.3或质荷比为263.5±0.3或质荷比为120.8±0.3或质本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.在生物学样品中检测25-羟基维生素D

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180129 US 62/623,4451.在生物学样品中检测25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的方法，包括：
处理样品以准备样品用于引入串联质谱；
在串联质谱的离子源中离子化所述经处理的样品以便产生所述25-羟基维生素D3(如果存在于所述样品中)的前体质子化离子，其质荷比为401.3±0.3，并且产生所述25-羟基维生素D2(如果存在于所述样品中)的前体质子化离子，其质荷比为413.3±0.3；
在所述串联质谱的第一分析仪中选择所述25-羟基维生素D3和所述25-羟基维生素D2的所述前体质子化离子；
碎片化25-羟基维生素D3的至少一部分所述经选择的质子化离子以产生具有257.2±0.3、121.1±0.3、133.1±0.3和147.1±0.3质荷比中任一种的至少一种碎片离子，和碎片化25-羟基维生素D2的至少一部分所述经选择的质子化离子以产生具有271.2±0.3、133.1±0.3、121.1±0.3和255.2±0.3质荷比中任一种的至少一种碎片离子；和
用所述串联质谱的第二分析仪，其设置为检测25-羟基维生素D3所述碎片离子中的所述至少一种和25-羟基维生素D2所述碎片离子中的所述至少一种，来鉴定所述样品中的任何所述25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2。


2.权利要求1的方法，其中所述处理样品步骤包括用至少一个LC柱来将所述25-羟基维生素D3和所述25-羟基维生素D2与样品的一种或多种其它组分选择性分离。


3.权利要求2的方法，其中使用至少一个LC柱的步骤包括用捕集柱来结合所述25-羟基维生素D3和所述25-羟基维生素D2和随后用分析柱来洗脱所述结合的25-羟基维生素D3和所述25-羟基维生素D2用于引入所述串联质谱。


4.权利要求3的方法，其中所述使用LC柱的步骤将所述25-羟基维生素D3和25-羟基维生素D2的至少一种与同量异序的干扰物拆分。


5.权利要求1的方法，其中所述离子化源包含电喷雾离子化源。


6.权利要求1的方法，还包括基于将相应于与25-羟基维生素D3有关的碎片离子的信号强度和相应于与25-羟基维生素D2有关的碎片离子的信号强度与得自至少一种标准品的各自信号强度比较来定量所述样品中所述25-羟基维生素D3和所述25-羟基维生素D2的浓度。


7.权利要求6的方法，其中所述处理样品步骤包括将所述至少一种标准品加入所述样品中。


8.权利要求6的方法，其中所述至少一种标准品包含氘化25-羟基维生素D3和氘化25-羟基维生素D2中的任意种。


9.权利要求1的方法，其中所述处理步骤包括使用沉淀剂和离心中的任意种。


10.权利要求1的方法，其中所述25-羟基维生素D2和25-羟基维生素D3是在所述串联质谱的单次运行中检测的。


11.在生物学样品中检测至少两种维生素D代谢物的方法，包括：
处理生物学样品以准备样品用于LC-MS/MS分析；
使所述经处理的样品通过具有出口连接至串联质谱入口的液相色谱柱，从而分离所述两种维生素D代谢物并将所述两种维生素D代谢物引入串联质谱；
在所述串联质谱中产生所述两种维生素D代谢物各自的[M+H]+离子；
对于与所述两种维生素D代谢物各自有关的各所述碎片离子[M+H]+离子产生至少一种碎片离子，其中所述碎片离子并非由于所述[M+H+]离子失水产生；和
检测所述碎片离子来鉴定所述两种代谢物在所述生物学样品中的存在。


12.权利要求11的方法，还包括通过将与所述碎片离子有关的检测信号强度和与至少一种标准品有关的各自信号比较来定量所述样品中所述两种维生素D代谢物的浓度。


13.权利要求12的方法，其中所述处理样品步骤包括将所述至少一种标准品加入样品中。


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【专利技术属性】
技术研发人员：J·J·寇尔诺耶，S·B·丹尼尔斯，A·J·胡德森，S·普尔卡亚沙，
申请(专利权)人：DH科技发展私人贸易有限公司，
类型：发明
国别省市：新加坡;SG