具有氨基的配体的固定化方法技术

本发明专利技术提供牢固地固定配体、并且剩余甲酰基的失活优异的固定化方法。本发明专利技术的将对目标化合物具有特异性亲和性且具有氨基的配体固定于含有甲酰基的不溶性基材的方法的特征在于包括以下工序：通过将上述配体和上述含有甲酰基的不溶性基材混合而形成亚胺的工序、以及通过使用2种以上的还原剂对亚胺进行还原的工序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】具有氨基的配体的固定化方法
本专利技术涉及将具有氨基的配体高效率地固定于含有甲酰基的不溶性基材的方法。
技术介绍
对特定的化合物具有特异性亲和性的肽、酶的底物等生物活性物质通过固定于不溶性的基材，可以回收、检测与被固定的生物活性物质发生相互作用的物质，因此可提高其利用性。例如，在亲和色谱中，通过将与目标化合物特异性结合的生物活性物质作为配体而固定于不溶性多孔粒子，可以从混合液中效率良好地仅对目标化合物进行回收。作为亲和色谱的工业利用例，可以举出：使用了被固定的蛋白质的免疫球蛋白分离、使用了被固定的抗体的抗原分离。作为将配体固定于不溶性基材的方式，为了减少被固定的配体的泄漏，以牢固的共价键进行固定在工业利用上是极其重要的。另外，同时，被固定的配体的状态也是很重要的，优选配体在保持了活性的状态下被固定。作为将配体固定于不溶性基材的方法，例如，开发了如下方法，该方法包括：将甲酰基导入不溶性基材，使该甲酰基与具有氨基的配体反应而形成亚胺，通过还原性氨基化反应进行固定，所述还原性氨基化反应是通过对亚氨基进行还原而形成稳定的胺的反应(专利文献1)。另外，公开了通过在相同的反应中使用专利文献2所示的各种特定的还原剂，从而可以显著地抑制配体的泄漏量的方法。现有技术文献专利文献专利文献1：日本特开2015-110224号公报专利文献2：国际公开第WO2017/034024号小册子
技术实现思路
专利技术要解决的课题然而，本专利技术人等发现，专利文献1的方法存在对配体泄漏量进行改进的余地，另外，专利文献2的方法在剩余的甲酰基的失活方面存在进行改进的余地。本专利技术对于上述改进点进行解决，提供抑制配体泄漏量且剩余的甲酰基的失活优异的固定化方法。解决课题的方法本专利技术人等为了解决上述的课题而进行了深入研究，结果发现，通过使用2种以上的还原剂，可以更可靠地将配体固定于不溶性基材，并且能够减少剩余的甲酰基，从而完成了本专利技术。即，本专利技术涉及下述的[1]～[9]。[1]将具有氨基的配体固定于含有甲酰基的不溶性基材的方法，该方法包括：通过将所述配体和所述含有甲酰基的不溶性基材进行混合，从而形成亚胺的工序；以及通过使用2种以上的还原剂，从而将所述亚胺还原的工序。[2]根据上述[1]所述的方法，其中，通过分别添加所述2种以上的还原剂，从而将所述亚胺还原。[3]根据上述[1]或[2]所述的方法，其中，作为所述还原剂，使用以pKa为6.5以下的路易斯碱为配位基的硼烷络合物之后使用其它还原剂，从而将所述亚胺还原。[4]根据上述[3]所述的方法，其中，所述pKa为6.5以下的路易斯碱是含氮杂环式芳香族化合物。[5]根据上述[1]～[4]中任一项所述的方法，其中，使用肽作为所述配体。[6]根据上述[5]所述的方法，其中，所述肽能够发生抗体特异性结合。[7]根据上述[1]～[6]中任一项所述的方法，其中，所述含有甲酰基的不溶性基材由选自多糖类、合成聚合物及玻璃中的至少1种构成。[8]根据上述[1]～[7]中任一项所述的方法，其中，所述甲酰基不溶性基材的形状是选自多孔粒子、整块料、以及多孔膜中的至少1种。[9]对目标化合物进行纯化的方法，该方法包括：通过上述[1]～[8]中任一项所述的方法将所述配体固定于所述含有甲酰基的不溶性基材，从而制造吸附体的工序；通过使包含所述目标化合物的混合液和所述吸附体接触，从而使所述目标化合物吸附于所述吸附体的工序；以及将吸附于所述吸附体的所述目标化合物从所述吸附体中分离的工序。专利技术的效果根据本专利技术，可以同时实现对配体泄漏量的显著抑制、及剩余甲酰基的充分失活。由此，本专利技术方法可以制造能够获得减少了杂质混入量的高纯度目标化合物的特异性吸附体，在工业上非常优异。具体实施方式以下，对于本专利技术的一个实施方式进行说明，但本专利技术并不限定于此。1.对不溶性基材导入甲酰基的工序在可以通过市售等方式得到含有甲酰基的不溶性基材的情况下，不需要实施本工序，但在无法获得的情况下，按照公知方法对不溶性基材导入甲酰基。不溶性基材只要对水等包含目标化合物的混合液的溶剂显示出不溶性、且可吸附目标化合物即可，没有特别限制。可以列举例如：用于色谱填充剂的多孔粒子、用于检测目标化合物的分析设备的生物传感器、用于目标化合物的分离回收、分析等的整块料、用于目标化合物的分离回收、夹杂物的去除等的多孔膜、蛋白质微阵列等芯片等。作为分析设备的生物传感器，可以举出利用了表面等离子共振、生物膜层干涉法的分析设备的传感器芯片。作为构成不溶性基材的材料，只要是对水等包含目标化合物的混合液的溶剂显示出不溶性的材料即可，没有特别限制，可以列举例如：纤维素、琼脂糖、葡聚糖、淀粉、普鲁兰多糖、壳聚糖(chitosan)、几丁质(chitin)等多糖类；聚(甲基)丙烯酸、聚(甲基)丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇等合成聚合物；二氧化硅玻璃、硼硅酸玻璃、光学玻璃、钠钙玻璃等玻璃。另外，可以用具有羟基等反应性官能团的高分子材料对由聚苯乙烯、苯乙烯-二乙烯基苯共聚物等不具有官能团的合成聚合物形成的基材的表面进行涂层。作为这样的涂层用高分子材料，可以举出具有甲基丙烯酸羟基乙酯、聚氧化乙烯链的单体与具有反应性官能团的其它聚合性单体的共聚物这样的接枝共聚物等。在上述材料中，由于容易将活性基团导入基材表面，因此优选使用多糖类、聚乙烯醇等。作为不溶性基材的形状，可以列举：多孔粒子、整块料、多孔膜。作为不溶性基材的多孔粒子的大小，可以适当调整，例如，以体积平均粒径计优选为20μm以上且1000μm以下。该体积平均粒径为20μm以上时，可以将填充于柱时的背压(backpressure)抑制得很低。另一方面，在该体积平均粒径为1000μm以下时，表面积增大，目标化合物的吸附量增大。作为该体积平均粒径，更优选为30μm以上，进一步优选为40μm以上，更进一步优选为50μm以上，而且更优选为250μm以下，进一步优选为125μm以下，更进一步优选为100μm以下，更进一步优选为85μm以下。多孔粒子的体积平均粒径可以对随机选择的100个多孔粒子的粒径进行测定而求出。各多孔粒子的粒径可以拍摄各多孔粒子的显微镜照片，保存为电子数据，并使用粒径测定软件(例如，MediaCybernetics公司制“Image-ProPlus”)来测定。为了提高强度等，多孔粒子优选通过通常方法利用多官能化合物进行交联。整块料是多孔连续结构体的一种，是支撑结构的骨架和空孔形成一体的海绵状的结构体。整块料显示出优异的质量传递性、压力流速特性，可以通过控制其空孔尺寸及骨架尺寸，提高目标化合物的吸附效率、分离效率、提高液体通过性、或者提高检测灵敏度。结构体为连续的多孔物质可以通过使用扫描电子显微镜观察等确认不同的截面具有结构相同的空孔来进行判断。作为多孔膜，可以列举具有平膜、中本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.将具有氨基的配体固定于含有甲酰基的不溶性基材的方法，该方法包括：/n通过将所述配体和所述含有甲酰基的不溶性基材进行混合，从而形成亚胺的工序；以及/n通过使用2种以上的还原剂，从而将所述亚胺还原的工序。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180112 JP 2018-0031001.将具有氨基的配体固定于含有甲酰基的不溶性基材的方法，该方法包括：
通过将所述配体和所述含有甲酰基的不溶性基材进行混合，从而形成亚胺的工序；以及
通过使用2种以上的还原剂，从而将所述亚胺还原的工序。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，
通过分别添加所述2种以上的还原剂，从而将所述亚胺还原。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，
作为所述还原剂，使用以pKa为6.5以下的路易斯碱为配位基的硼烷络合物之后使用其它还原剂，从而将所述亚胺还原。


4.根据权利要求3所述的方法，其中，
所述pKa为6.5以下的路易斯碱是含氮杂环式芳香族化合物。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的方...

【专利技术属性】
技术研发人员：铃木琢磨，
申请(专利权)人：株式会社钟化，
类型：发明
国别省市：日本;JP