【技术实现步骤摘要】
表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建及其应用方法
本专利技术涉及病毒的构建及其应用方法，更具体一点说，涉及表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建及其应用方法，属于生物技术与基因领域。
技术介绍
恶性肿瘤统称为癌症，是当前严重影响人类健康，威胁人类生命的疾病之一，是当今世界严重的公共卫生问题之一，每年至少有700万人死于癌症，根据2019年一月我国癌症中心发布的统计数据显示，恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，且近十几年来恶性肿瘤的发病死亡均呈持续上升态势，每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿，防控形势严峻。目前癌症治疗最广泛三种主要方法，其为外科手术、化疗，放疗，其中传统的手术存在治疗对于早期的癌症治疗效果较好，但往往潜在的转移与扩散造成了手术的失败；化疗由于其毒副作用大主要用于晚期癌症，放疗也存在较大的副作用，因此传统的方法或许不能有效遏制癌症的发展，随着对癌症发生机制的深入研究，逐渐出现新的治疗方法，包括基因治疗，病毒疗法。目前为止，肿瘤的基因疗法已经取得一定的进展，基于基因疗法与病毒疗法均有很好的治疗效...
【技术保护点】
1.表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于该构建方法包括如下步骤：/n步骤1)将目的基因直接人工合成到pCA13质粒载体上得到pCA13-gene，用BglII单酶切从pCA13上切下携带目的基因的表达框；/n步骤2)将携带目的基因的表达框直接连接到同样BglII单酶切的pSD55质粒上，获得pSD55-gene；/n步骤3)：将pSD55-gene质粒用PmeI线性化，将线性化的pSD55-gene质粒转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生含有目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；/n步骤4)将MluⅠ鉴定正确的...
【技术特征摘要】
1.表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于该构建方法包括如下步骤：
步骤1)将目的基因直接人工合成到pCA13质粒载体上得到pCA13-gene，用BglII单酶切从pCA13上切下携带目的基因的表达框；
步骤2)将携带目的基因的表达框直接连接到同样BglII单酶切的pSD55质粒上，获得pSD55-gene；
步骤3)：将pSD55-gene质粒用PmeI线性化，将线性化的pSD55-gene质粒转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生含有目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；
步骤4)将MluⅠ鉴定正确的重组质粒用PacⅠ酶切线性化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后，得到目的溶瘤腺病毒ZD55-gene。
2.根据权利要求1所述的表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于：所述目的基因为合成基因IL-33。
3.根据权利要求1所述的表达白介素33的重组溶瘤腺病毒的构建方法，其特征在于该构建方法包括如下步骤：
步骤1)：人工合成鼠IL-33至pCA13载体的多克隆位点，获得pCA13-Kozak-CD8-IL-33-HA质粒，其中，在合成鼠IL-33时，在IL33表达框5’端加入Kozak与人CD8α信号序列，并在表达框的末端加入HA标签，获得综合序列，通过将综合序列直接合成至pCA13多克隆位点的HindIII与XbaI间，获得pCA13-Kozak-CD8-IL-33-HA质粒；
用BglII单酶切pCA13-Kozak-CD8-IL-33-HA质粒，获得完整表达框；
步骤2)：将表达框连接到同样经BglII单酶切腺病毒穿梭质粒载体pShuttle-Surp-E1A-△E1B55kD上，得到含有目的基因的pSD55-IL-33质粒；
步骤3)：将质粒pSD55-IL-33用PmeI线性化，将线性化的质粒pSD55-IL-33转化到含有全序列腺病毒骨架DNA的质粒Adeasy-1大肠杆菌BJ5183中重组，产生含有目的基因的腺病毒骨架DNA质粒载体；
步骤4)：重组质粒MluⅠ单酶切鉴定有五条带为鉴定正确标准，将MluⅠ鉴定正确的重组质粒用PacI酶切线性化、去磷酸化后，转染到293A细胞中进行病毒包装，待细胞出现病变后得到重组溶瘤腺病毒。
4.根据权利要求3所述的表达白介素33的重组溶...
【专利技术属性】
技术研发人员：王毅刚，胡艳平，黄芳，黄飚，周秀梅，贾晓渊，刘新垣，
申请(专利权)人：浙江理工大学绍兴生物医药研究院有限公司，浙江理工大学，浙江省人民医院，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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