一种病毒保存液及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种能够保存免提取的病毒核酸样品的保存液。本发明专利技术的保存液采用非离子型表面活性剂温和裂解细胞释放病毒核酸，提供的核酸稳定缓冲液在常温运输和保存以及高温灭活病毒处理过程中有效保证病毒核酸免遭降解，降低检测假阴性结果。而且，本发明专利技术的病毒保存液中不含PCR抑制剂，可免核酸提取操作，直接作为样本模板进行后续（RT‑）PCR核酸检测实验，大大简化病毒检测流程和时间，有效提高疫情防控的反应速度和有效性。

【技术实现步骤摘要】
一种病毒保存液及其应用
本专利技术涉及一种病毒保存液，特别涉及一种能够能保存免提取的病毒核酸样品的保存液，属于分子生物学

技术介绍
2019年底爆发的病毒感染性肺炎（COVID-19）对全人类的健康造成巨大威胁，并造成重大经济损失。快速、准确的病原诊断是有效治疗、病情监测和控制疾病蔓延的重要前提。目前，通过实时荧光定量聚合酶链式反应（qPCR）筛查和确诊病患是新冠肺炎防控的主要手段。如何保证核酸检测结果的及时性和准确性对当前疫情防控具有非常重大的意义。病毒（Virus）是一种具有比较原始的生命形态和生命特征的非细胞生物，通常由基因组和外壳蛋白构成。病毒的核酸是最难以稳定保存的生物分子之一，主要在于其存在自降解和生物酶导致的降解。因此，病毒核酸样本的保存和运输通常是决定病毒样本质量及其检测质量的关键因素，尤其是RNA病毒。因此，通常含有RNA病毒的样本建议存放于专用的病毒保存液中，并在冷藏状态下（即4℃或更低温度）保存。在烈性传染的病原核酸临床检测中，临检人员易受到传染病原暴露的威胁，需要采取严格的防护设备和措施以降低临检人员感染风险。鉴于新型冠状病毒感染聚集性发病，感染性极强，且有重症病例，并有死亡病例，根据国家卫健委颁布的《新型冠状病毒感染的肺炎实验室检测技术指南》规定，感染性材料或活病毒在实验活动过程中要按照病原微生物危害程度分类中第二类病原微生物进行管理，在采用可靠的方法灭活后（例如将样品在56℃孵育30-45分钟或更高温度进行病毒灭活）可在BSL-1实验室操作。但是由于RNA核酸不稳定的特点，高温灭活过程可能造成病原核酸降解，进而影响检测的准确性，造成假阴性的结果。自新冠肺炎疫情发生以来，核酸检测假阴性率过高一直是各方关注的焦点，以荧光定量RT-PCR作为检测手段的新冠病毒检测的阳性率目前仅有30%—50%，极大的增加了疫情控制的难度。因此，如何在保护临检人员安全的基础上有效保存、运输病原样本，并保证后续核酸检测结果的准确性，临床上对病原核酸样本采集和保存提出了更高的要求。此外，由于病毒保存主要是解决样本保存和运输中的问题，后续检测是以病毒核酸分离提取为前提，样本在实施PCR等核酸检测之前需要分离提纯等步骤以除去样本中的蛋白变性剂、去垢剂等裂解试剂，这增加了实验操作步骤和样本受到污染的几率。随着核酸扩增技术的发展，直接扩增技术已经开始普遍应用于核酸检测分析中，而传统的病毒保存试剂中常含有（RT-）PCR抑制剂，如果直接与PCR试剂混合，会抑制核酸扩增，因此，非免提取型病毒保存液在对接后续的直接扩增技术方面受到限制。中国专利CN111321123A“一种免核酸提取的病毒保存液”中提供了一种包含A和B两种组分的免核酸提取DNA/RNA病毒保存液，其原理是通过A组分（pH为1.0-5.0）提供的酸性缓冲液条件下，高活性的酸性蛋白酶释放DNA/RNA核酸，使病毒毒力下降或变成无毒，再通过包含中性或偏碱性缓冲液的B组分（pH为7.0-9.0）中和A组分中的酸性缓冲液，从而使酸性蛋白酶失活，避免酸性蛋白酶对PCR等核酸扩增的不利影响。但是，DNA在酸性环境下很容易降解，特别是在pH小于5的强酸性条件下，非常不利于病毒DNA核酸的保存，即使对于RNA的保存，强酸性条件也是不利的，因此，该病毒保存液虽然能做到免核酸提取，但是其对病毒的保存效果有待进一步提高。中国专利CN109402240A9“核酸释放剂、核酸PCR扩增方法和PCR扩增试剂盒”公布了一种可简化RNA样品PCR扩增方法的核酸释放剂，可以使含有RNA的样品在室温下直接释放出RNA，并且能够与PCR反应液直接混合进行PCR扩增，但是在将所述核酸释放剂与病毒样品混合之前，还包括样品的预处理步骤：将样品与聚乙二醇混合，然后离心取沉淀，这增加了样本处理的步骤。此外，所述核酸释放剂中含有蛋白酶K和强碱氢氧化钠等成分，也可能会对后续PCR产生不利影响。中国专利CN110982876A“病毒核酸检测的预处理方法、预处理液、试剂盒及其用途”中提供了一种免提取的病毒样本预处理液，将存放在预处理液中的样本与核酸释放剂（CN109402240A9提供）和qPCR扩增试剂混合（带有样本的预处理液：核酸释放剂：PCR扩增试剂=10:10:30），能够在不需要对样本进行核酸提取或纯化的情况下，直接搭配强碱性质下的样本核酸释放剂和高兼容性的扩增体系进行直接的样本核酸扩增检测，但是该专利所述预处理液包括大约10mM的EDTA-2Na，由于在PCR反应体系中0.5mMEDTA残留即可显著降低PCR产量，1mMEDTA即可完全抑制PCR反应，因此该专利提供的病毒样本预处理液可能对后续PCR扩增产生不利影响，进而影响病毒检测灵敏度，可能会造成假阴性的结果。此外，所述预处理液只是作为病毒样本预处理，需要与专利CN109402240A9提供的核酸释放剂组合使用才能释放病毒核酸作为PCR检测的模板。鉴于以上技术存在的问题，本专利技术提供一种免核酸提取的病毒保存液，该保存液采用非离子型表面活性剂温和裂解细胞释放病毒核酸，提供的核酸稳定缓冲液在常温运输和保存以及高温灭活病毒处理过程中有效保证病毒核酸免遭降解，降低检测假阴性结果。此外，样本保存液中不含PCR抑制剂，可免核酸提取操作，直接作为样本模板进行后续（RT-）PCR核酸检测实验。本专利技术方法将对病毒的核酸检测从原本相对繁琐的方法（包括步骤：1）采集样本；2）加入病毒专用保存液，冷冻运输；3）病毒经56℃以上孵育30分钟灭活；4）核酸提取；5）（RT-）PCR检测）改进到一种相对简单的方法（包括步骤：1）采集样本；2）加入病毒保存液，常温运输和保存；3）病毒经56℃以上孵育30分钟灭活；4）（RT-）PCR检测），大大简化病毒检测流程和时间，有效提高疫情防控的反应速度和有效性。
技术实现思路
从理论上，病毒保存液一般包含细胞裂解剂、核酸酶抑制剂、核酸稳定剂、抗菌剂和抗氧化抑制剂，这些试剂组分协同作用可以有效灭活样本中的病原微生物并高效释放和保存核酸。但是这些试剂组分如胍盐、EDTA、SDS和尿酸的存在或者残留会对后续的PCR扩增过程产生明显的抑制，0.005%的SDS或0.5mMEDTA残留即可显著降低PCR产量，0.01%的SDS、1mMEDTA或0.1-1ng/μL的酸类物质即可完全抑制PCR反应。因此，为了达到既能有效裂解细胞释放和保存病毒核酸，又能在免提取的条件下使保存液中的有效成分不会对后续PCR核酸检测产生不利影响，本专利技术提供一种免提取的病毒保存液，并将之应用于病毒核酸PCR检测中。本专利技术提供的病毒保存液采用非离子型表面活性剂温和裂解细胞释放核酸，提供的核酸稳定缓冲液能在常温运输保存以及56℃高温灭活处理过程中有效保证病毒核酸稳定，免遭降解，降低检测假阴性结果。此外，保存液中不含EDTA、SDS等强PCR抑制剂，并加入BSA、DMSO等PCR反应增强剂，保存的病毒样本溶液免提取操作，可直接作为样本模板进行后续的病毒核酸（RT-）PCR检测，简化病毒检测流程和时间，有效提高疫情防控的反应时效。为了实现上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液包含：10–200 mM Tris -HCl、0.05-1％（w/v）的Triton-100、1-10 mM 的DTT和/或5-30 mM TCEP·HCl，病毒保存液pH值7-9。/n

【技术特征摘要】
1.一种病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液包含：10–200mMTris-HCl、0.05-1％（w/v）的Triton-100、1-10mM的DTT和/或5-30mMTCEP·HCl，病毒保存液pH值7-9。


2.根据权利要求1所述的病毒保存液，其特征在于：所述病毒保存液还包含1–10μg/μl的BSA、0.1%–5%（v/v）的DMSO和1%–10%（v/v）的甘油。


3.根据权利要求2所述的病毒保存液，其特征在于，所述病毒保存液由以下组分组成：10–200mMTris-HCl、0.05-1％（w/v）的Triton-100、1-10mM的DTT和/或5-30mMTCEP·HCl，1–10μg/μl的BSA、0.1%–5%（v/v）的DMSO、...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘淑君，殷剑峰，肖欢欢，王春香，
申请(专利权)人：北京健为医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11