一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，该方法充分利用Trans well小室独特的滤膜装置，运用材料中特有的聚碳酸酯膜组成的微孔滤膜，将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，从而将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰，探究出分离附睾头部精子释放蛋白的技术要点。本发明专利技术分离的精子释放蛋白的成功率高、操作简便、蛋白降解率低、稳定性高，费用低，可替代传统的精子蛋白混合取样不能明确来源的缺陷，避免了精子质膜成分与结构蛋白对分泌蛋白精准分离的误差影响。

【技术实现步骤摘要】
一种利用TransWell小室分离精子释放蛋白的方法
本专利技术属于生化
，具体是一种利用TransWell小室分离精子释放蛋白的方法。
技术介绍
附睾是哺乳动物精子成熟、获得受精能力、储存和保护精子的重要器官，其作为精子到达输精管的通道，附睾液中的蛋白质由附睾上皮分泌并与精子相互作用或被吸收到精子表面，为精子的成熟和储存提供特殊的微环境。附睾液微环境的组成随着精子通过的不同区段而发生复杂和连续的变化。附睾头部、体部和尾部的基因表达相差较大，头部已被证明是蛋白合成和分泌非常活跃的区域，而体部和尾部较少。目前研究还发现大部分不呈区域化表达蛋白属于组成性蛋白，而分泌到附睾管腔液的蛋白则呈现高度的区域化，而且在附睾管腔中极少有蛋白存在连续分泌现象。目前的研究主要集中在附睾液中蛋白的种类和作用，而对于处在附睾微环境中精子释放蛋白的探究较少。蛋白质组学是一门新兴学科，它以大规模、高通量系统的方式研究某种类型的细胞、组织或体液含有所有蛋白质的功能。Transwell小室(Transwellchamber、Transwellinsert)由美国康宁(corning)开发生产，该材料中间有一层聚碳酸酯膜(polycarbonatemembrane)组成的微孔滤膜将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，根据不同细胞其体积不同，孔径为0.1-12μm不等，主要应用于共培养、趋化、迁移、侵袭等细胞实验。本研究将充分利用Transwell小室独特的滤膜装置，将精子细胞与释放蛋白分离为两部分，同时，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰，探究出分离猪附睾头部精子释放蛋白的新方法。以上
技术介绍
内容的公开仅用于辅助理解本专利技术的专利技术构思及技术方案，其并不必然属于本专利申请的现有技术，在没有明确的证据表明上述内容在本专利申请的申请日已经公开的情况下，上述
技术介绍
不应当用于评价本申请的新颖性和创造性。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种利用TransWell小室分离精子释放蛋白的方法。本方法能够充分利用Transwell小室独特的滤膜装置，将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰。分离精子释放蛋白的成功率高、操作简便、蛋白降解率低、稳定性高、费用低等优点。为了实现以上目的，本专利技术采用的技术方案如下：一种利用TransWell小室分离精子释放蛋白的方法，包括如下步骤：(1)取性成熟的动物摘除附睾，剔除脂肪组织和结缔组织，用PBS冲洗血迹，浸润在生理盐水中，在附睾头部、附睾尾切出一个小孔，以便空气可以流通，保持管腔内大气压恒定，用注射器针头缓慢刺入附睾头部曲细精管内，轻轻挤压曲细精管并抽取精液，用EP管收集；(2)收集到的精子在室温下离心后，弃去上清，保留沉淀，悬浮于1mLNC-BWW培养液中；将NC-BWW培养液作为稀释液将精子浓度调整为2-5×105；调整好浓度的精子孵育30-60min；(3)将孵育后的精子进行分离，取稀释后的精子细胞溶液2mL在单个Transwell小室内进行培养，所述Transwell小室是由聚碳酸酯膜隔开的上室和下室孔组成；将Transwell小室孵育30-60min，以便精子在生理状态下正常分泌蛋白，将上、下室的组分用2mLEP管分别收集，上室收集的组分为精子，下室收集的组分为精子释放蛋白及培养液，并将样品置于-80℃保存。优选的，步骤(2)和步骤(3)的孵育是在37℃、5％CO2、95％空气的环境中孵育。优选的，所述离心是在转速为2000-3000r/min离心10-20min。优选的，所述聚碳酸酯膜的孔径为0.4μm。运用材料中特有的聚碳酸酯膜组成的微孔滤膜，将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，从而将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰。优选的，步骤(2)稀释时运用台盼蓝染色测定精子浓度。优选的，所述动物为5-6月龄的猪。优选的，所述生理盐水的温度为37℃。与现有技术相比，本专利技术的优点及有益效果为：1、本专利技术方法充分利用Transwell小室独特的滤膜装置，运用材料中特有的聚碳酸酯膜组成的微孔滤膜，将孔板内的培养空间分为上、下室两部分，从而将精子细胞与释放蛋白分离开，消除了因上、下室培养液成分不同、作用条件不同等造成的实验干扰，是一种分离附睾头部精子释放蛋白的新方法。2、本专利技术分离精子释放蛋白的成功率高、操作简便、蛋白降解率低、稳定性高，费用低，可替代传统的精子蛋白混合取样不能明确来源的缺陷，避免了精子质膜成分与结构蛋白对分泌蛋白精准分离的误差影响。附图说明图1为待测蛋白的SDS-PAGE电泳结果。其中M:蛋白Marker；1:Trans-Well上室收集蛋白；2：Trans-Well下室收集蛋白。图2为一级质谱母离子容差分布图；图3为蛋白分子量分布图；图4肽段长度分布图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术作进一步详细说明。应该强调的是，下述说明仅仅是示例性的，而不是为了限制本专利技术的范围及其应用。实施例1一种利用TransWell小室分离精子释放蛋白的方法，包括如下步骤：(1)取性成熟的长白猪(6月龄)摘除成熟附睾，剔除脂肪组织和结缔组织，用PBS冲洗3次以洗去血迹，浸润在预热的37℃生理盐水中，在附睾头部、附睾尾切出一个小孔，以便空气可以流通，保持管腔内大气压恒定，用5mL注射器针头缓慢刺入附睾头部曲细精管内，轻轻挤压曲细精管并抽取精液，用1.5mLEP管收集；(2)收集到猪精子室温下3000r/min离心10min后，弃去上清，保留沉淀，悬浮于1mLNC-BWW培养液中；运用台盼蓝染色测定精子浓度，将NC-BWW培养液作为稀释液将精子浓度调整为2-5×105；调整好浓度的精子要在在37℃，5％CO2，95％空气的环境中孵育30min以便精子恢复正常生命状态。在整个孵育过程中定期将精子悬浮液轻轻混合以防止细胞沉降，并在孵育结束时再次评估精子活力和运动性。(3)将孵育后的精子进行分离，取稀释后的精子细胞溶液2mL在单个Transwell小室内进行培养，所述Transwell小室是由聚碳酸酯膜隔开的上室和下室孔组成，微孔滤膜的孔径大小使精子释放的蛋白及培养液进入下室，而整个精子细胞被滤膜阻挡保留在上室；将在37℃、5％CO2、95％空气的环境中孵育30min，以便精子在生理状态下正常分泌蛋白，将上、下室的组分用2mLEP管分别收集，上室收集的组分为精子，下室收集的组分为精子释放蛋白及培养液，并将样品置于-80℃保存。所述Transwell小室的直径为0.4μm，确保精子的头部、尾部或整个精子细胞被阻挡并保留在上室。为了验证本方法的准确性，专利技术人经过以下方法进行验证。从-80℃冰箱取出样品，低温研磨成粉，迅速转移至液氮预冷的离心管，加入适量蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种利用Trans Well小室分离精子释放蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：/n(1)取性成熟的动物摘除附睾，剔除脂肪组织和结缔组织，用PBS冲洗血迹，浸润在生理盐水中，在附睾头部、附睾尾切出一个小孔，以便空气可以流通，保持管腔内大气压恒定，用注射器针头缓慢刺入附睾头部曲细精管内，轻轻挤压曲细精管并抽取精液，用EP管收集；/n(2)收集到的精子在室温下离心后，弃去上清，保留沉淀，悬浮于1mL NC-BWW培养液中；将NC-BWW培养液作为稀释液将精子浓度调整为2-5×10

【技术特征摘要】
1.一种利用TransWell小室分离精子释放蛋白的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)取性成熟的动物摘除附睾，剔除脂肪组织和结缔组织，用PBS冲洗血迹，浸润在生理盐水中，在附睾头部、附睾尾切出一个小孔，以便空气可以流通，保持管腔内大气压恒定，用注射器针头缓慢刺入附睾头部曲细精管内，轻轻挤压曲细精管并抽取精液，用EP管收集；
(2)收集到的精子在室温下离心后，弃去上清，保留沉淀，悬浮于1mLNC-BWW培养液中；将NC-BWW培养液作为稀释液将精子浓度调整为2-5×105；调整好浓度的精子孵育30-60min；
(3)将孵育后的精子进行分离，取稀释后的精子细胞溶液2mL在单个Transwell小室内进行培养，所述Transwell小室是由聚碳酸酯膜隔开的上室和下室孔组成；将Transwell小室孵育30-60min，以便精子在生理状态下正常分泌蛋白，将上、下室的组分用2mLEP管分别收集，上室收集的组分为精子，下室收集的组分为精子释放蛋白及培养液，并将样品置于-80℃保存。...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡传活，葛晨玲，李珣，王晓晔，
申请(专利权)人：广西大学，
类型：发明
国别省市：广西;45