一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法技术

本发明专利技术公开了一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法，它包括如下步骤：1)取全血，加分离液混合，静置；2)取步骤1)所得上清液，2～8℃保存1‑2天，即得PBMC悬液；或：取步骤1)所得上清液，离心，取下层细胞，加保存液重悬，‑150℃冻存180～360天，即得冻存PBMC。本发明专利技术分离PBMC的方法，与常用方法相比大大节省了血样处理时间，简化了操作步骤，减少了对离心机等仪器的依赖，可用于病房，诊所及事故发生地血样的及时处理，并用于流式细胞检测CD4和CD8，具有实际推广应用价值。

【技术实现步骤摘要】
一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法
本专利技术具体涉及一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法。
技术介绍
PBMC(Peripheralbloodmononuclearcell)即外周血单个核细胞，指外周血中具有单个核的细胞，包括淋巴细胞和单核细胞。人体免疫细胞，如CIK细胞、DC细胞、NK细胞、DC-T细胞，均由PBMC诱导分化而来，若要获得上述免疫细胞，需要先自外周血中分离PBMC。外周血含有血小板、PBMC、红细胞和多核白细胞等多种细胞，PBMC的密度与其他细胞不同，红细胞和多核白细胞密度较大，为1.090kg/m3左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090kg/m3，血小板为1.030～1.035kg/m3。为此利用一种密度介于1.075～1.092kg/m3之间而近于等渗的溶液(分层液)做密度梯度离心，使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，便可将各种血细胞加以分离。常用的PBMC分离方法有Ficoll分离法和Percoll分离法两种。Percoll分离法操作流程较长，手续较为繁琐；相比之下Ficoll分离法较为常用，但是，Ficoll分离法存在Ficoll分离液用量大，分层不明显等缺点，专利CN105255829A对Ficoll分离法进行了改进，但仍然存在步骤繁琐，处理时间长的缺点。细胞流式检测是利用细胞表面特异性的抗原，把不同细胞分开并进行定量统计的方法，对细胞的活性要求较高，因此一般都采用Percoll或Ficoll基础的密度梯度离心法获得PBMC进行下游操作。小量实验时可使用低渗透压裂解红细胞的方法(裂红法)代替，但是样本量大时裂红法需要试剂量大，难以控制裂红时间，往往造成裂红不充分，或目的细胞死亡。无论Percoll和Ficoll分离法，都需要对血液样本进行密度梯度离心，在离心后吸取特定的细胞层，对仪器和技术人员依赖较大。在基层医院收集样本时，往往没有实验条件进行此类操作。而如果不进行分离，红细胞很快会裂解并导致其他细胞的死亡。羟基淀粉沉淀法(HES法)虽然也用于分离细胞，但是该方法分离的细胞中混有一定量的红细胞，且羟基淀粉黏附在细胞上，会影响后续的流式分析/分选，因此目前还没有用羟基淀粉沉淀法分离细胞做流式分析。因此，专利技术一种简单，有效，对实验条件和人员技术水平要求较低的，且可以用于后续流式分析/分选重要免疫细胞的分离方法非常必要。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法，它包括如下步骤：1)取全血，加分离液混合，静置，2)取步骤1)所得上清液，2～8℃保存1-2天，即得PBMC悬液；或：取步骤1)所得上清液，离心，取下层细胞，加保存液重悬，-150℃冻存180～360天，即得冻存PBMC。进一步地，所述全血与分离液的体积比为3～6：1，优先体积比为5：1。更进一步地，所述分离液是羟乙基淀粉溶液。更进一步地，所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉分子量为45～70万，优选48万；和/或，所述羟乙基淀粉溶液浓度为4～8％，优选6％。进一步地，所述全血为混有抗凝剂的全血；所述抗凝剂与全血的质量体积比为1.2～2.4mg：1mL，优选1.8mg：1mL。更进一步地，所述抗凝剂是EDTA。进一步地，所述静置温度20～30℃，时间25～45min，优先温度25℃，时间35min。进一步地，所述离心的转速100～300×g，温度为2～8℃，时间3～8min，优选离心转速200×g，温度为4℃，时间5min。进一步地，所述保存液重悬后每1ml含1x106细胞。更进一步地，所述保存液是胎牛血清和二甲基亚砜组成的混合溶液；所述胎牛血清与二甲基亚砜的体积比为9：1。进一步地，所述流式细胞检测的是免疫细胞表面抗原CD家族，优选检测免疫细胞CD8和/或CD4。本专利技术分离PBMC的方法，与常用方法相比大大节省了血样处理时间，简化了操作步骤，减少了对离心机等仪器的依赖。经试验证明，通过本专利技术方法分离得到的PBMC，其存活率，CD4+T细胞和CD8+T细胞比例与目前常用方法无显著差异，保证了PBMC的质量。本专利技术方法得到的PBMC虽然仍混有一定数目的红细胞，导致淋巴细胞百分比与其他方法相比有所减少，但重要免疫细胞CD4+T细胞比例与其他方法没有显著差异，对后续流式细胞CD4的检测结果不造成影响。由此可见，本专利技术分离PBMC的方法，可用于病房，诊所及事故发生地血样的及时处理，并用于流式细胞检测重要免疫细胞CD4、CD8，具有实际推广应用价值。显然，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本专利技术的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本专利技术上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本专利技术上述内容所实现的技术均属于本专利技术的范围。附图说明图1实验例1中PBMC存活率流式细胞术分析图(第一行：Ficoll法PBMC平均存活率94.5％，第二行：HBS+Ficoll法PBMC平均存活率94.2％，第三行：HBS法PBMC平均存活率95％)图2实验例1中PBMC流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞比例图图3实验例2中PBMC存活率流式细胞术分析图(第一行：Ficoll法PBMC平均存活率88.6％，第二行：HBS+Ficoll法PBMC平均存活率79.4％，第三行：HBS法PBMC平均存活率78.1％)图4实验例2中PBMC流式细胞术分析CD4+T和CD8+T细胞比例图图5实验例3中流式细胞术分析Ficoll法和本专利技术方法分离的PBMC(第一行：Ficoll法，第二行：本专利技术方法)具体实施方式实施例1、本专利技术分离PBMC的方法取加入抗凝剂(EDTA，其与全血质量体积比为1.8mg/mL)的全血(六个样本)，与6％羟乙基淀粉溶液(羟乙基淀粉分子量48万)以体积比5：1混合，25℃静置30min，吸取上清，4℃保存1-2天，即得PBMC悬液，在1～2天内用于流式细胞检测。实施例2、本专利技术分离PBMC的方法取加入抗凝剂(EDTA，其与全血质量体积比为1.8mg/mL))的全血(六个样本)，与6％羟乙基淀粉溶液(羟乙基淀粉分子量48万)以体积比5：1混合，室温静置30min，吸取上清，在转速200g，温度4℃条件下，离心5分钟，取下层细胞，以每1ml重悬1x106细胞的量加入冻存液(90％胎牛血清(FBS)+10％二甲基亚砜(DMSO)组成的冻存液)，-150℃冻存180～360天，即得冻存的PBMC，180～360天内用于流式细胞检测。以下通过试验例来说明本专利技术的有益效果。实验例1将同一血液样本各分3份，分别采用Ficoll法，本专利技术短期保存的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法，其特征在于：它包括如下步骤：/n1)取全血，加分离液混合，静置，/n2)取步骤1)所得上清液，2～8℃保存1-2天，即得PBMC悬液；或：/n取步骤1)所得上清液，离心，取下层细胞，加保存液重悬，-150℃冻存180～360天，即得冻存PBMC。/n

【技术特征摘要】
1.一种可用于流式细胞检测的简便PBMC分离方法，其特征在于：它包括如下步骤：
1)取全血，加分离液混合，静置，
2)取步骤1)所得上清液，2～8℃保存1-2天，即得PBMC悬液；或：
取步骤1)所得上清液，离心，取下层细胞，加保存液重悬，-150℃冻存180～360天，即得冻存PBMC。


2.根据权利要求1所述PBMC分离方法，其特征在于：所述全血与分离液的体积比为3～6：1，优先体积比为5：1。


3.根据权利要求1或2所述PBMC分离方法，其特征在于：所述分离液是羟乙基淀粉溶液。


4.根据权利要求3所述PBMC分离方法，其特征在于：所述羟乙基淀粉溶液中羟乙基淀粉分子量为45～70万，优选48万；和/或，所述羟乙基淀粉溶液浓度为4～8％，g/ml，优选6％，g/ml。


5.根据权利要求1或2所述PBMC分离方法，其特征在于：所述全血为混有抗凝剂的全血；所述抗凝剂与全血的质量...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟大超，吴沙沙，周轶，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51