散射辅助超定位显微术方法及相关装置制造方法及图纸

一种荧光显微术方法，包括以下步骤：A.用相干激发光束(5)照射包括一个或多个荧光发射体的散射样品，相干激发光束的波前具有第一初始配置C

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】散射辅助超定位显微术方法及相关装置***本专利技术涉及一种以简单、可靠、适应性强且经济的方式增加荧光显微术装置对不透明或散射样品的光学分辨率而不增加装置复杂性的方法。这种方法利用样品本身散射的光来增加显微术装置的有效数值孔径，从而克服了所使用的光收集光学系统(即物镜)的分辨率。这种方法基于散射样品上激发相干光束的波前相位和/或振幅调制，以从由样品散射的光束中建立相长干涉，从而产生紧密的聚焦，并且这种方法基于对由样品散射的光的控制。具体地，根据本专利技术的方法使由生物组织的荧光蛋白发出的荧光信号的强度最大化，并且将在反复优化后从在遍及样品的不同位置产生的多个焦点产生的荧光中获得的信息集合成图像，该图像的分辨率不受照明和收集光学器件的限制。进一步地，本专利技术涉及一种光学分辨率提高的荧光显微术装置。尽管本专利技术主要面向生物学样品的探究，其中实验条件要求将荧光信号收集光学器件定位成远离样品，但是必须记住，在其他领域例如天文和大气，或出于安全或民用目的而进行的远距离调查，本专利技术可以应用于由其他散射样品产生的荧光信号，仍处于所附权利要求所定义的保护范围之内。由阿贝(Abbe)和瑞利(Rayleigh)制定的衍射极限指出，透镜可获得的最大分辨率由数值孔径NA定义。照明和收集光学器件的立体角越大，成像系统可获得的空间分辨率就越高。Tang等人的论文“Superpenetrationopticalmicroscopybyiterativemultiphotonadaptivecompensationtechnique”，ProceedingsoftheNationalAcademyofSciences,109,8434-8439(2012)，和NiN.等人的论文“Adaptiveopticsviapupilsegmentationforhigh-resolutionimaginginbiologicaltissues”，Naturemethods7,141-147(2010)公开了如何使用适应性光学器件校正光学像差以获得真实透镜的理论分辨率。如以下论文所公开的，可以通过超分辨率技术绕开这种理论分辨率：Betzig,E.等人的论文“Imagingintracellularfluorescentproteinsatnanometerresolution”Science313,1642-1645(2006)；diHell，S.W.和Wichmann，N.的论文“Breakingthediffractionresolutionlimitbystimulatedemission:stimulated-emission-depletionfluorescencemicroscopy”,Opticsletters19,780-782(1994)；Schermelleh,L.等人的论文“Aguidetosuperresolutionfluorescencemicroscopy”,TheNournalofcellbiology190,165-175(2010)；diLeung,B.O.和Chou,K.C.的论文“Reviewofsuper-resolutionfluorescencemicroscopyforbiology”,Appliedspectroscopy65,967-980(2011)；Pawley,N.B.的论文FundamentalLimitsinConfocalMicroscopy，20-42(Springer美国，波士顿，马萨诸塞州，2006年)；Betzig,E.和Trautman,N.K.的论文“Near-fieldoptics:microscopy,spectroscopy,andsurfacemodificationbeyondthediffractionlimit”，ScienceS1,189-196(1992)；以及Gustafsson,M.G.的论文“Surpassingthelateralresolutionlimitbyafactoroftwousingstructuredilluminationmicroscopy”，Journalofmicroscopy198,82-87(2000)。Izeddin,I.等人的论文“PSFshapingusingadaptiveopticsforthree-dimensionalsingle-moleculesuper-resolutionimagingandtracking”，OpticsExpress20卷,第5期,第4957-4967页(2012)中描述了现有技术的荧光显微术方法和相关装置的另一示例。所提出的解决方案具有许多缺点。首先，可以通过常规的光学显微术装置实现的最大分辨率需要将透镜定位成靠近样品，这在非侵入性和体内测量中可能是严重的限制。此外，高数值孔径NA是目前大多数显微技术中必不可少的成分，但旨在绕过衍射极限，例如共聚焦、近场、结构化照明、激发发射损耗、或光激活定位显微术。最终，例如来自不透明组织的散射通常被视为这些显微术完美聚焦的障碍，因光学像差而使波前形状劣化并且限制可获得的分辨率。例如，大多数脊椎动物组织(包括人类)看起来是光学上不透明的，从而进入皮肤一部分的相干光束漫射到许多不相关的光路中，并且经过一定距离(传输平均自由程，l)后，它们的行进方向是完全随机化的。本专利技术的目的是克服所描述的缺点，允许以可靠、简单且经济的方式独立于显微镜光学器件的数值孔径NA并且以非侵入性的方式来增加荧光显微术装置的光学分辨率。本专利技术的具体主题是一种荧光显微术方法，所述方法包括以下步骤：A.用相干激发光束照射包括一个或多个荧光发射体的散射样品，所述相干激发光束的波前具有第一初始配置C1以便激发所述散射样品中所包括的所述一个或多个荧光发射体；B.通过像素成像单元采集与所述散射样品的背景图像对应的第一初始图像F1，F1＝FB，从而获得散斑颗粒图像；C.选择坐标为[xN,yN]的M个目标像素PN，所述M个目标像素属于所述第一初始图像F1的具有至少一个荧光发射体的荧光信号的区域，其中N＝1、…、M，所述M个目标像素PN中的每个目标像素均具有第一初始强度IPN1；D.针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，优化所述波前的所述第一初始配置，以便减小所述第一初始图像F1的散斑颗粒尺寸，并且获得所述散射样品的最终图像F最终(IPN最大)，所述最终图像F最终(IPN最大)具有所述荧光信号的局部最大值IPN最大，所述局部最大值对应于所述目标像素PN的最大强度；E.针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，从在步骤D获得的所述最终图像F最终(IPN最大)中减去在步骤B获得的背景的所述第一初始图像FB，针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，获得图像F散斑(PN)，所述图像F散斑(PN)仅具有从位于强度为IPN散斑的像素[xN,yN]处的散斑颗粒而来的荧光信号；F.针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，用具有自由中心坐标的高斯函数对在步骤E中获得本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种荧光显微术方法，包括以下步骤：/nA.用相干激发光束(5)照射包括一个或多个荧光发射体的散射样品，所述相干激发光束的波前具有第一初始配置C

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180327 IT 1020180000039841.一种荧光显微术方法，包括以下步骤：
A.用相干激发光束(5)照射包括一个或多个荧光发射体的散射样品，所述相干激发光束的波前具有第一初始配置C1以激发所述散射样品中所包括的所述一个或多个荧光发射体；
B.通过像素成像单元(45)采集与所述散射样品的背景图像对应的第一初始图像F1，F1＝FB，从而获得散斑颗粒图像；
C.选择坐标为[xN,yN]的M个目标像素PN，所述M个目标像素PN属于所述第一初始图像F1的具有至少一个荧光发射体的荧光信号的区域，其中N＝1、…、M，所述M个目标像素PN中的每个目标像素均具有第一初始强度
D.针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，优化所述波前的所述第一初始配置，以便减小所述第一初始图像F1的散斑颗粒尺寸，并且获得所述散射样品的最终图像F最终(IPN最大)，所述最终图像F最终(IPN最大)具有所述荧光信号的局部最大值IPN最大，所述局部最大值对应于所述目标像素PN的最大强度；
E.针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，从在步骤D获得的所述最终图像F最终(IPN最大)中减去在步骤B获得的背景的所述第一初始图像FB，针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，获得图像F散斑(PN)，所述图像F散斑(PN)仅具有从位于强度为IPN散斑的像素[xN,yN]处的散斑颗粒而来的荧光信号；
F.针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，用具有自由中心坐标的高斯函数对在步骤E中获得的所述图像F散斑(PN)进行拟合，从而获得xy平面中的坐标(XN,YN)和强度IN；
G.针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，生成包含高斯分布的图像FN，所述高斯分布以在步骤F中获得的坐标(XN,YN)为中心并且具有强度IN、并且具有等于所述散射样品的平均散斑颗粒尺寸S的束腰；
H.针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，通过对在步骤G获得的所述M个图像FN求和来生成所述样品的最终图像。


2.根据权利要求1所述的显微术方法，其中，针对所述M个目标像素PN中的每个目标像素，步骤D包括以下子步骤：
D.1-将所述波前的所述第一初始配置C1设置为所述波前的参考配置C1＝C参考，将所述第一初始图像F1设置为参考图像F1＝F参考，并且将所述第一初始图像F1的所述目标像素PN处的第一强度设置为所述目标像素PN处的参考强度
D.2–将以下子步骤循环重复T次，其中T>1：
D.2.1-通过振幅和/或相位调制单元(10)改变所述波前的所述参考配置C参考，以获得所述波前的第i配置Ci；
D.2.2...

【专利技术属性】
技术研发人员：马可·莱奥尼蒂，朱塞佩·安东尼奥奇，雷诺·塞卡雷利，
申请(专利权)人：顶峰光学有限公司，意大利技术学院基金会，
类型：发明
国别省市：意大利;IT