幼鱼或鱼受精卵的DNA鉴定性别的方法技术

本发明专利技术提供一种青鳉鱼受精卵或幼鱼的ＤＮＡ鉴定性别的方法，属于鱼类胚胎和早期发育研究领域。该方法包括单个鱼卵或幼鱼的ＲＮＡ和ＤＮＡ同步提取技术；用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取ＲＮＡ后，剩余有机相中加入ＤＮＡ提取缓冲液，混匀，５０℃－７５℃温浴后，低温离心１０－１５分钟，呈现上下两层，取上层水相加入核酸共沉剂，加入无水乙醇，离心，去除上清，酒精清洗，ＮａＯＨ溶液溶解，调ｐＨ至８．０－８．４，得到单个鱼卵或幼鱼的ＤＮＡ溶液；将提取的溶液作为模板ＤＮＡ，加入性别特异ＰＣＲ引物，进行ＰＣＲ反应，ＰＣＲ反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测，如出现目的条带为ＸＹ型雄鱼，未出现该条带为ＸＸ型雌鱼。本发明专利技术鉴定准确性高、效果显著。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于鱼类胚胎和早期发育研究、发育毒理学研究、环境毒理学研究和环境监测领域，具体涉及一种受精卵(胚胎)或幼鱼的DNA提取并鉴定性别的方法。
技术介绍
鱼类是发育生物学、遗传学、毒理学及环境监测等诸多学科和领域的重要试验生物。其中，青鳉鱼是一种用于研究性别分化机理很好的实验动物。但是在胚胎和幼鱼发育早期，青鳉鱼的性别是很难从形态和颜色确定的。一直以来，青鳉鱼的早期胚胎发育研究，特别是性别分化研究是通过性逆转建立YY染色体型雄鱼和XX染色体型雌鱼繁殖产生单一XY染色体型雄性受精卵(胚胎)和幼鱼，或建立XX染色体型雄鱼和XX染色体型雌鱼繁殖产生单一XX染色体型雌性受精卵(胚胎)和幼鱼进行研究的。但是这种方法在培养性逆转亲鱼的过程中要施加大量激素，现在的研究证明亲代受到激素污染会对后代胚胎和幼鱼的正常发育有影响。因此这种方法对研究鱼类的正常发育可信度受到质疑。特别是在研究环境内分泌干扰物质(EDCs)对鱼类早期性别分化和发育影响时，使正常试验结果的可靠性大大降低。因此建立一种能够从单卵中同步提取RNA和DNA，用RNA研究基因表达状况，DNA鉴定性别的系统方法是非常有必要的。虽然现在生物技术中，RNA和DNA的提取方法有很多，但是大多需要时间较长，程序复杂，且效率不稳定。Trizol试剂以其简便、快捷的特点成为现在提取RNA的首选。Trizol试剂的配方(按1L配制)水饱和酚380mL 38％(pH 4.8-5.2)；异硫氰酸胍118.16g终浓度0.8M；硫氰酸铵76.12g，终浓度0.4M；3M乙酸钠溶液33.4mL(pH 5.0)，终浓度0.1M；甘油50mL 5％。但是目前Trizol试剂提取DNA的方法十分麻烦，效果不稳定，很难满足试验的要求。
技术实现思路
本专利技术针对目前Trizol试剂提取DNA的方法所存在的问题，提出一种提取幼鱼或鱼受精卵DNA并鉴定性别的新方法，可实现单个鱼卵或一条幼鱼的RNA和DNA的同步提取，然后采用DNA进行PCR反应鉴定性别，其准确性高。一种幼鱼或鱼受精卵的DNA鉴定性别的方法，步骤包括(1)将单个鱼卵或幼鱼在Trizol试剂中匀浆；(2)在匀浆液中加入氯仿，混匀，低温高速离心，分离RNA和DNA；(3)用Trizol试剂提取RNA后，剩余有机相中加入DNA提取缓冲液，混匀，50℃-75℃温浴后，低温离心10-15分钟，呈现上下两层上层水相，下层有机相； (4)取上层水相加入核酸共沉剂，加入无水乙醇，离心，去除上清，酒精清洗，NaOH溶液溶解，调pH至8.0-8.4，即得到单个鱼卵或鱼苗的DNA溶液；(5)将提取的DNA溶液作为模板DNA，加入PCR引物进行PCR反应，PCR反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测，出现条带的为XY型雄鱼，未出现该条带为XX型雌鱼。DNA提取缓冲液(DNA Extraction Buffer，DEB)各组分浓度为3.5-4M异硫氰酸胍，0.1-0.5M硫氰酸铵，20-50mM柠檬酸钠，1M Tris。核酸共沉剂制备糖元经过DEPC(焦碳酸二乙酯)处理一段时间后，加乙醇沉淀；再经过Trizol处理纯化，得到的无RNA酶和DNA酶的糖元即是一种核酸共沉剂。PCR引物(青鳉鱼专用)为引物15’-CCTGAAGTGGTGGTGAAGAATG-3’引物25’-CTGGACGATGAAGCAGAGTAGC-3’反应液为常规。PCR反应过程中预变性的温度为94-97℃。本专利技术的优点与技术效果较好的分离不同发育阶段的单个鱼胚胎和幼鱼的RNA和DNA，RNA可用于检测不同发育时期的基因表达状况，DNA用于鉴定性别。本专利技术对Trizol试剂提取DNA的方法进行了革新，使组织样品RNA和DNA的提取得以同步进行。本专利技术为从基因表达角度研究青鳉鱼的早期胚胎发育提供了基本方法，使通过单个受精卵基因表达变化来检测环境内分泌干扰物质的工作能够进行。本专利技术单卵和幼鱼性别鉴定准确性达到100％。附图说明图1本专利技术新方法与传统方法提取10mg青鳉鱼肝脏中DNA的效果比较1表示本方法提取DNA的效果；2表示某公司Trizol试剂提供DNA提取方法的效果；本方法提取效率显著高；图2本专利技术对11尾成熟雄鱼和11尾成熟雌鱼的性别验证效果图，结果表明本方法的鉴定结果与实际情况完全相符(以青鳉鱼为例)；图3本专利技术对随机取来的24粒孵化5天的受精卵进行的性别鉴定结果。具体实施例方式首先进行核酸共沉剂制备，将普通肝糖元进行无RNA酶和DNA酶处理，具体的制备方法为将糖元经过DEPC处理8个小时以上；然后加乙醇沉淀；再经过Trizol处理纯化，可得到无RNA酶和DNA酶的糖元。该糖元用作核酸共沉剂。然后，进行DNA提取缓冲液(DNA Extraction Buffer，DEB)各组分浓度为3.5-4M异硫氰酸胍，0.1-0.5M硫氰酸铵，20-50mM柠檬酸钠，1M Tris。采用本专利技术方法的实施例一将一个5天的青鳉鱼受精卵用液氮速冻，然后将其用200微升Trizol试剂迅速匀浆；将匀浆液转移至1.5毫升离心管中；再用100微升Trizol试剂清洗匀浆器3次，清洗液合并入匀浆液。再加入100微升氯仿，混匀2分钟；4℃12000g离心15分钟。呈现上下两层1.收集上层水相并转移至一无RNA酶和DNA酶的1.5毫升离心管中，加100微克糖元(无RNA酶和DNA酶)混匀，加入300微升异丙醇混匀，4℃ 12000g 10min离心沉淀RNA，倒掉上清液，75％DEPC水配制的酒精清洗RNA，4℃ 12000g 5min，吸去酒精，空气中干燥5分钟(至酒精挥发完即可)，加20微升DEPC水溶解RNA。2.向下层有机相中加入DNA提取缓冲液150微升，混匀，55℃温浴，4℃ 12000g 15min离心15分钟。收集上层水相转移至一新的1.5毫升离心管中，加入100微克核酸共沉剂，混匀。加入无水乙醇，混匀。4℃ 12000g离心10分钟，去除上清，保留沉淀。75％酒精清洗两遍。空气中干燥5分钟(至酒精挥发完即可)，NaOH溶液溶解DNA，调pH至8.4。该DNA可用于PCR检测。参考图1，本方法提取DNA效率比现有技术显著提高。采用上述方法制得的基因组DNA作为模板，进行PCR反应。PCR反应液配制5微升10×Taq buffer；25mM Mg2+；4微升dNTP(各2.5mM)；1.5单位Taq酶；1微升引物1(20μM)；1微升引物2(20μM)。加灭菌蒸馏水至50微升。引物15’-CCTGAAGTGGTGGTGAAGAATG-3’引物25’-CTGGACGATGAAGCAGAGTAGC-3’PCR反应条件预变性96℃，30秒40个循环96℃，10秒；60℃，1分钟延伸72℃，6分钟PCR反应完成后。参考图2、参考图3，按照此实施例提取DNA，并进行PCR反应后，1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，850bp出现条带者为XY型(雄鱼)，未出现者为XX型(雌鱼)。对24粒孵化5天的受精卵进行的性别鉴定结果，雌雄分别为1212。♂表示XY型雄性，♀表示XX型雌性。采用本专利技术方法的实施例二将一条孵化2天的青鳉鱼幼鱼用液氮速冻，然后用200微升Trizol试剂迅速匀浆；将匀浆液转移至1.5毫升离心本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种幼鱼或鱼受精卵的ＤＮＡ鉴定性别的方法，步骤包括：（１）将单个鱼卵或幼鱼在Ｔｒｉｚｏｌ试剂中匀浆；（２）在匀浆液中加入氯仿，混匀，低温高速离心，分离ＲＮＡ和ＤＮＡ；（３）用Ｔｒｉｚｏｌ试剂提取ＲＮＡ后，剩余有机相中 加入ＤＮＡ提取缓冲液，混匀，５０℃－７５℃温浴后，低温离心１０－１５分钟，呈现上下两层：上层水相，下层有机相；（４）取上层水相加入核酸共沉剂，加入无水乙醇，离心，去除上清，酒精清洗，ＮａＯＨ溶液溶解，调ｐＨ至８．０－８．４，即得到幼 鱼或单个鱼卵的ＤＮＡ溶液；（５）将提取的ＤＮＡ溶液作为模板ＤＮＡ，加入ＰＣＲ引物进行ＰＣＲ反应，ＰＣＲ反应完成后，琼脂糖凝胶电泳检测，出现目的条带者为ＸＹ型雄鱼，未出现该条带者为ＸＸ型雌鱼。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张照斌，胡建英，安伟，
申请(专利权)人：北京大学，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]