一种通过同时识别多个表位来检测CatD蛋白的方法技术

本发明专利技术采用能识别特定三肽序列ＫＡＩ，ＧＥＬ，ＤＧＩ和ＬＡＳ的寡聚核苷酸适配子来证实，方法为：利用Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－ｓｗｉｔｃｈ将寡聚核苷酸适配子进行延长并将其５’端进行磷酸化修饰，同时合成四条连接子；利用ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ　　ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　　ＤＮＡ　　Ｌｉｇａｔｉｏｎ技术将结合到靶蛋白上的寡聚核苷酸适配子连接成单链环状ＤＮＡ；随后采用滚环ＤＮＡ复制的方法进行扩增检测信号；结果表明该技术可以非常灵敏的检测靶蛋白，其检测浓度最低可以达到ｎＭ级；这种方法具有灵活性可以根据需要对配体的数目进行调整；这种技术也可以检测蛋白复合物，对以寡聚核苷酸适配子为配体的芯片技术提供了灵敏的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质组学的研究技术，具体涉及识别蛋白质表位的寡聚核苷酸适配子(Nucleic Acid Aptamer)用于同时识别多个表位来检测蛋白质或者蛋白复合物的方法。
技术介绍
蛋白质的表达可以以单体存在，也可以以二聚体存在，还有更复杂的多蛋白形成的复合物，对这些蛋白乃至复合物的检测是非常重要的，特别是在蛋白组学研究中，我们不仅要知道有什么样的蛋白表达，同时我们还要知道蛋白的状态，包括修饰和复合物。因此对蛋白的检测特别是蛋白翻译后的各种状态的检测是至关重要的。对蛋白组学的研究需要高通量技术和灵敏的检测手段，最近二维电泳技术和以抗体为配体的蛋白芯片为相关研究提供了重要的工具，但是由于各自的局限性需要更灵敏便捷的方式来检测蛋白。以滚环DNA复制和proximity dependent DNA ligation等原理设计出来的各种方法可以检测SNP和蛋白等，但都有一些缺点。在蛋白检测中，proximity dependent DNA ligation的方法可以检测微量蛋白，但是由于其所采用的最后定量的方法是荧光定量PCR的方法，经常会由于PCR扩增的非特异性或者是寡核苷酸适配子的GC含量过高导致无法进行PCR反应，为此就不得不延长辅助片断。此外这种方法只能针对同种蛋白的二元复合物的相同表位进行检测。当然这种方法的主要缺点是有背景连接反应的存在，需要对其反应条件进行繁琐的优化以尽量减少干扰。这种方法最多也只能同时检测两个表位，因此对于蛋白组学的研究需要更灵活的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在提出一种通过同时识别多个蛋白表位来检测特定的蛋白或者蛋白复合物的方法，从而克服上述已问世蛋白检测方法的缺陷。这种应用多个寡聚核苷酸适配子同时识别含有相应序列的蛋白质的方法为用靶向于不同表位的寡聚核苷酸适配子利用proximitydependent DNA Ligation的原理将其连接成单链环状DNA，然后检测单链环状DNA。其具体做法是I、将合成的寡聚核苷酸适配子进行适当延长、并分别使两臂的序列与寡核苷酸适配子互补，再将其5’端进行磷酸化修饰；II、在反应体系中加入上述各种寡核苷酸适配子和蛋白质室温放置1小时，然后加入连接子，连接酶缓冲液和连接酶；III、采用滚环DNA复制进行检测。靶向于三肽KAI，GEL，DGI和LAS的寡聚核苷酸适配子的核苷酸序列为GEL-寡聚核苷酸适配子gcgaagcggg ctgaagtgca cacagctgga ggagtattgt tgggtgctcKAI-寡聚核苷酸适配子gcgcagcggg tggagtgtta agatgaattg cggtgtgggc cggcctctat tggcLAS-寡聚核苷酸适配子acgaagtggg tgtatagcga ataatcatta agaaagggcg ctgtgttgtgDGI-寡聚核苷酸适配子agcctaaaat attgcttagta agggtggtct ggctccgaga ggggt寡聚核苷酸适配子可以识别蛋白中的相应三肽序列，并且可以从重组大肠杆菌粗裂解液中捕获和纯化含有相应三肽序列的CathepsinD(CatD)蛋白。即重组表达的CatD蛋白含有四个可以被识别的表位。为了检验实验的特异性还用到了翻译后修饰过的CatD蛋白(含有三个可以识别的表位)等。根据本专利技术提出的这种检测方法的使用结果表明该技术可以非常灵敏的检测靶蛋白，其检测浓度最低可以达到fM级。这种方法具有灵活性可以根据需要对配体的数目进行调整。这种技术也可以检测蛋白复合物，对以寡聚核苷酸适配子为配体的芯片技术提供了灵敏的检测方法。附图说明图1为CatD蛋白检测结果 A定量PCR中样品放置位置图，其中标出在实验中有信号的两个位置8，9；B为18小时后电泳结果(从右向左的样品依次为1为Marker；2，3为BSA；4，5为1.0aM CatD；6，7为100.0aM CatD；8，9为10.0fM CatD)；C为定量检测结果数据，其中标出在实验中有信号的两个样品的位置8，9；D为定量检测结果数据经软件分析后的结果，其中标出在实验中有信号的两个样品的位置8，9。图2为CatD蛋白检测特异性结果从右向左的样品依次为1为BSA；2为1.0aM CatD；3为100.0aM CatD；4，5为10.0fM CatD；6为10.0nM mCatD；7为1.0nM mCatD；CatD含有四个可检测表位；mCatD为成熟蛋白只含有三个可检测的表位。下面结合附图进一步详述本专利技术。利用Structure-switch寡聚核苷酸适配子技术使适配子与蛋白质相应三肽的结合并促进连接反应Structure-switch signaling寡聚核苷酸适配子技术的主要方法是将寡聚核苷酸适配子进行末端延长后，使其能够同时跟寡聚核苷酸适配子内部退火结合，此时两臂不能与连接子结合发生连接反应，没有信号产生。当寡聚核苷酸适配子的靶蛋白出现时，靶蛋白与寡聚核苷酸适配子结合，从而导致两臂能够与连接子结合从而促进连接反应。这样有利于背景连接反应的降低。(1)根据寡聚核苷酸适配子序列合成structure-switch寡聚核苷酸适配子和相应的连接子。GELacttcagccc ttttttttaa tcacttatgc gaagcgggct gaagtgcaca cagctggaggagtattgttg ggtgctcttt ctcctccagcKAIttaacactcc ttttttttat cttgcgcagc gggtggagtg ttaagatgaa ttgcggtgtgggccggcctc tattggcttt cccacaccgcLAScgctatacac ttttttatca cttatacgaa gtgggtgtat agcgaataat cattaagaaagggcgctgtg ttgtgttttt cctttcttaaDGItaagcaatat tttatcactt atccatagcc taaaatattg cttagtaagg gtggtctggctccgagaggg gttgaattct gagccagaccconnector 1aaagggctga agtggtctgg ctctttconnector2aaaggagtgt taagctggag gagtttconnector3aaagtgtata gcggcggtgt gggtttconnector4aaaatattgc ttattaagaa aggttt(2)在PCR管中加入1.0uL 100pM的四种寡核苷酸适配子混合液后，分别加入不同浓度的BSA和CatD等蛋白室温放置1小时；再分别加入含有0.1uL 25uM的四种连接子和1.0U的T4DNA Ligase的缓冲液，室温放置5小时进行连接反应；然后采用phi29 DNA聚合酶对环状单链DNA于30℃进行扩增；最后用定量PCR和琼脂糖电泳进行检测。本技术可以采用多个寡聚核苷酸适配子来检测蛋白，由于寡聚核苷酸适配子具有类似于抗体的性质，而且具有抗体难以达到的优点如化学稳定性等。因此本技术可以作为以寡聚核苷酸适配子作为蛋白配体的芯片的信号检测方法。本技术可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过同时识别多个表位来检测蛋白或蛋白复合物的方法，其特征在于：用靶向于不同表位的寡聚核苷酸适配子利用ｐｒｏｘｉｍｉｔｙｄｅｐｅｎｄｅｎｔＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎ的原理将其连接成单链环状ＤＮＡ，然后检测单链环状ＤＮＡ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：牛文泽，江楠，胡应和，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]