高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法技术

本发明专利技术属于细胞分离培养技术领域，具体涉及一种高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法。针对现有大/小鼠乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞分离效率低、活性差、操作条件不易控制的问题，本发明专利技术提供了一种方法，包括以下步骤：a、取乳鼠心脏，清洗后转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎；b、组织块在分离液中消化后，吸走上清，剩余物中加入消化液，消化；c、移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对下部的组织块再加入消化液消化；d、悬浮液混合，离心，弃上清，重悬细胞，孵育，成纤维细胞和心肌细胞。本方法能够高效分离心肌细胞，得到的心肌细胞活性高，得率高；还能同时获得心肌成纤维细胞，适宜工业化生产。

【技术实现步骤摘要】
高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法
本专利技术属于细胞分离培养
，具体涉及一种高效分离培养乳鼠心肌细胞和心肌成纤维细胞的方法。
技术介绍
心肌细胞和心肌成纤维细胞是心脏生长发育、生理、代谢、病理等研究中的主要研究对象。因此，心肌细胞和心肌成纤维细胞原代培养技术已经广泛应用于心血管疾病基础研究及心血管药物开发等研究中。目前，对大/小鼠乳鼠的心肌细胞和成纤维细胞的分离方法有：1、机械分离法；2、Langendorff离体灌流法；3、酶消化法。其中Langendorff法需要特殊的设备，且操作复杂，多用于大/小鼠成鼠的分离；机械分离法对细胞损伤较大，细胞存活率较低；酶消化操作简单，对细胞伤害较小，细胞得率高，能够更高效地分离和培养大/小鼠乳鼠原代心肌细胞和成纤维细胞。专利CN104830759A公开了一种大鼠乳鼠心肌细胞的分离方法，该方法采用单纯胰蛋白酶消化分离心肌细胞的方法。胰蛋白酶消化的原理是使细胞间的蛋白质水解，从而使细胞离散。但是胰蛋白酶对细胞的伤害极大，很难控制单次消化时间和吹打细胞的力度，并且胰蛋白酶工作效率与动本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：/na、取乳鼠心脏，置于含Blebbistatin的PBS溶液中清洗后，转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎心脏成小的组织块；/nb、将步骤a所述组织块在10～15ml分离液中消化，2～8℃消化4～12小时后，吸走上清，剩余物中加入消化液，在37℃下消化20～30min；/nc、步骤b消化完成后，采用移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对静置后下部的组织块再加入消化液，在37℃下消化20～30min，直至无肉眼可见组织块；/nd、将步骤c消化后得到的悬浮液混合，离心，弃上清，采用铺板培养基重悬细胞，孵育30～60min...

【技术特征摘要】
1.高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、取乳鼠心脏，置于含Blebbistatin的PBS溶液中清洗后，转移至含胰蛋白酶的分离液中，剪碎心脏成小的组织块；
b、将步骤a所述组织块在10～15ml分离液中消化，2～8℃消化4～12小时后，吸走上清，剩余物中加入消化液，在37℃下消化20～30min；
c、步骤b消化完成后，采用移液管吹打混匀，静置，转移上部悬浮液，对静置后下部的组织块再加入消化液，在37℃下消化20～30min，直至无肉眼可见组织块；
d、将步骤c消化后得到的悬浮液混合，离心，弃上清，采用铺板培养基重悬细胞，孵育30～60min，成纤维细胞铺于相应孔板中，上清中的细胞即为心肌细胞。


2.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤a所述的Blebbistatin为购自MedChemExpress公司的货号为HY-13813的产品，浓度为3～5uM。


3.根据权利要求1所述的高效分离培养乳鼠心肌细胞及心肌成纤维细胞的方法，其特征在于：步骤a所述的分离液组成包括：3～5uMBlebbistatin，0.25％胰蛋白酶，不含钙镁的HBSS缓冲液。


4.根据权利要求...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄方洋，李君丽，田格尔，周骏腾，
申请(专利权)人：四川大学华西医院，
类型：发明
国别省市：四川;51