本发明专利技术公开了一种３，５－二硝基水杨酸肼酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、特异性抗体溶液、３，５－二硝基水杨酸肼标准溶液、酶标板、样品稀释液、洗涤液、二抗溶液、显色液Ａ液、显色液Ｂ液和终止液，所述特异性抗体为兔抗３，５－二硝基水杨酸肼抗体，所述酶标板为孔内包被有半抗原与卵清蛋白偶联物的ＥＬＩＳＡ板条，所述二抗溶液为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体稀释液。待测样品经过盐酸水解、邻硝基苯甲醛衍生、乙酸乙酯提取、样品稀释液复溶和正己烷脱脂等样品前处理步骤后，使用本试剂盒进行检测分析。本发明专利技术所述试剂盒特异性强、最低检测限为７４．８ｐｐｔ，适合于卫生、质监、海关、肉品加工厂、家畜养殖场对饲料、肉类、尿液、乳品等样品中的３，５－二硝基水杨酸肼进行快速检测。
【技术实现步骤摘要】
,5-二硝基水杨酸肼酶联免疫检测试剂盒及其使用方法
本专利技术属于免疫化学
，具体涉及一种，5-二硝基水杨 酸肼酶联免疫检测试剂盒及其使用方法。
技术介绍
， 5-二硝基水杨酸肼作为硝呋索尔的代谢物，能够标示违禁兽药 硝呋索尔的使用情况。我国出口欧盟的鸡肉等产品多次被检出，5-二硝基水杨酸肼残留，严重制约了我国动物源性食品的出口，损害了 我国畜牧业的良好形象。因此，为了保障人民身体健康，保证进出口 肉产品的质量，有利于大力发展我国畜牧业，有必要寻求一种快速、 灵敏、方便的方法来检测动物肌肉组织的， 5-二硝基水杨酸肼残留。目前报道的， 5-二硝基水杨酸肼残留量的检测方法主要有液-质 联用(LOMS)法、高效液相-质谱联用法(HPLC-MS)，但这些方法样品 前处理很复杂，仪器成本高，耗时费力。酶联免疫检测方法(ELISA) 能弥补这些不足，因而可被用于农兽药残留的快速检测，但目前尚未 有, 5-二硝基水杨酸肼的酶联免疫检测方法的报道，要采用酶联免 疫方法进行快速、灵敏、方便的检测，关键需要找到针对,5-二硝 基水杨酸肼残留检测的样品的前处理简单方法以及合适的抗体、包被 原等，但目前尚未有， 5-二硝基水杨酸肼的酶联免疫检测方法的相 关技术报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术的不足，提供一种可用于动物源性食品中， 5-二硝基水杨酸肼残留的快速检测试剂盒。本专利技术的另一个目的是提供所述试剂盒的使用方法，通过简单、 特殊设计的样品衍生化前处理，极大地提高了试剂盒检测的特异性和 灵敏度。本专利技术的专利技术目的通过以下技术方案来予以实现提供一种， 5-二硝基水杨酸肼酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、 特异性抗体溶液、， 5-二硝基水杨酸肼标准溶液、酶标板、样品稀释 液、洗涤液、二抗溶液、显色液A液、显色液B液和终止液，所述特 异性抗体为兔抗， 5-二硝基水杨酸肼抗体，所述酶标板为孔内包被 有半抗原与卵清蛋白偶联物的ELISA板条，所述二抗溶液为辣根过氧 化物酶标记的羊抗兔抗体稀释液。所述的半抗原为，5-二硝基水杨酸肼和对羧基苯甲醛反应，通 过氨醛縮合所得化合物，具有式(I )所示的结构所述的特异性抗体溶液是由化合物(I)偶连牛血清蛋白得到的 偶联物，经透析纯化，免疫实验用兔，纯化兔血清，调配浓度得到的 抗体溶液；所述偶联物具有式(II )所示结构<formula>formula see original document page 7</formula>所述的半抗原与卵清蛋白偶联物是由化合物(I )与卵清蛋白通 过活泼酯法交联后，透析纯化的产物，具有式(III)所示结构<formula>formula see original document page 7</formula>本专利技术同时提供了所述试剂盒的使用方法，包括以下步骤(1) 样品衍生化前处理；(2) 在试剂盒的酶标板孔中加入50 u L溶解有样品的抗体稀释 液和50 u L特异性抗体溶液，室温反应0min，洗涤液洗涤，拍干；() 在(2)所述酶标板孔中加入二抗稀释液lOOuL，室温反 应20min，洗涤液洗涤，拍干；(4) 在()所述酶标板孔中加入现配的显色液100pL，室温 蔽光显色10min;(5) 在(4)所述酶标板孔中加入终止液体50nL，测定0D450值。歩骤(1)所述样品衍生化前处理包括盐酸水解、邻硝基苯甲醛 衍生、乙酸乙酯提取、样品稀释液复溶和正己烷脱脂步骤。例如可取lg的鱼肉或虾肉样分别加入4mL的蒸馏水，0. 5 mLl mol/L的HCL和 100 ii L 10 mraol/L的2-硝基苯甲醛，充分振荡；在7。C过夜孵育(大约16小时)；分别加入5 ml 0. 1 mol/L K2HP04， 0. 4 mL lmol/L Na0H 和5 mL的乙酸乙酯，剧烈振荡0秒钟，在室温下离心，5000 r/min， 10分钟；取出乙酸乙酯层置另一个容器中蒸干，用0.5mL的正己烷 溶解干燥物，用0.5 mL的PBST适当的混合，在室温下离心，5000 r/min， 10分钟，取用50 uL的下层液体进行试剂盒检测分析。歩骤(4)所述现配的显色液是由显色A液体显色B液按照1: 1的体积比配制。本专利技术的有益效果是本专利技术采用间接竞争ELISA法，通过半抗 原合成，偶连载体蛋白，免疫实验动物，抗体纯化等技术手段，制备 了高灵敏度，高特异性的抗体；通过合成包被原，并将其按一定浓度 包被在ELISA板上，使用甘氨酸封闭，制备可以直接应用于酶联免疫 分析的ELISA板条；制定了测定，5-二硝基水杨酸肼残留的试剂盒 使用步骤，通过简单、特殊设计的衍生化前处理，极大地提高了试剂 盒检测的特异性和灵敏度，简化了试剂盒检测的操作；本专利技术可用于 动物肌肉、肝脏中,5-二硝基水杨酸肼的检测，具有前处理简单、 检测快速、高通量和廉价等优点，并且最低检测限为0. lng/mL。 附图说明图1抗原、蛋白和半抗原紫外扫描图谱图2试剂盒的标准曲线 具体实施例方式下面结合附图和具体实施历来进一步详细说明本专利技术。 实施例1半抗原的合成在50ml圆底烧瓶中加入间羧基苯甲醛lOranol，缓慢加入甲醇直 至间羧基苯甲醛至完全溶解，搅拌中加入8mmo1， 5-二硝基水杨酸肼， 室温搅拌过夜；反应结束过滤，20mL甲醇分两次洗涤沉淀，干燥， 黄色粉末状固体即为CPDNSH: APCI-MS (negative) m々74—. ^ 画R(600MHz, J6-DMSO， TMS): 5 14.05 (s， 1H); 8.82 (d， J:.0Hz， 1H); 8.58 (d, /=.0Hz, IH); 8.48(s, 1H); 8.5(s， 1H); 7.97 (t, /=7.8Hz, 1H); 7.59(t，/=7.7Hz, 1H)。其结构如式(I )所示实施例2抗原的合成取半抗原CPDNSHO. lmmol溶于2 mLDMF中，搅拌加入DCC 27. 5 mg 和NHS14.4 mg， 4 。C下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液； 称取BSA 140 mg溶于10 mL浓度为0. 1 mol/L的PBS(PH8. 0)中，加 入DMFlmL，搅拌溶解制备B液；磁力搅拌下，A液逐渐滴入B液中，4 t:下反应12 h;离心后，取上清夜，4 。C下用生理盐水透析 d， 每天更换次透析液，得到的全抗原CPDNSH-BSA。以1 g/L浓度分 装。冻存于-20 'C冰箱中，供免疫用。CPDNSH-BSA的结构如式(II) 所示N02(II)实施例包被原的合成取半抗原CPDNSH 0. lmmol溶于2 mLDMF中，搅拌加入DCC 27. 5 mg和NHS14. 4 mg， 4 。C下磁力搅拌反应过夜，离心后上清夜为A液； 称取牛血清蛋白BSA 140 mg溶于10 mL浓度为0. 1 mol/L的PBS (PH8. 0) 中，加入DMF1 mL，搅拌溶解制备B液；磁力搅拌下，A液逐渐滴入 B液中，4"C下反应12h;离心后，取上清夜，4 'C下用生理盐水透 析 d，每天更换次透析液，得到的包被原CPDNSH-OVA。以l g/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种３，５－二硝基水杨酸肼酶联免疫检测试剂盒，包括盒体、特异性抗体溶液、３，５－二硝基水杨酸肼标准溶液、酶标板、样品稀释液、洗涤液、二抗溶液、显色液Ａ液、显色液Ｂ液和终止液，其特征在于所述特异性抗体为兔抗３，５－二硝基水杨酸肼抗体，所述酶标板为孔内包被有半抗原与卵清蛋白偶联物的ＥＬＩＳＡ板条，所述二抗溶液为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体稀释液。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈玉栋，张世伟，孙远明，雷红涛，王弘，肖治理，杨金易，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]
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