一种土壤真菌拮抗模型的构建方法技术

本发明专利技术涉及生物技术，具体的说是一种土壤真菌拮抗模型的构建方法。具体为：将采集的土样高压高温，建立土壤抑真菌能力逐渐降低的土壤真菌拮抗模型，通过如下步骤进行构建：１）采集土壤样品；２）高压高温处理土壤样品；３）检测真菌拮抗功能。本发明专利技术模型构建方法简便可行，一般实验室均可操作，且耗时短。并且该模型可应用于不同土壤样品，研究不同土壤的真菌拮抗功能，发现土壤特异的抑真菌微生物；不仅可以研究土壤细菌群落结构，还可以研究真菌以及放线菌等其它微生物的群落结构组成与真菌拮抗功能的关系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术，具体的说是。
技术介绍
Dobbs C. G.和HinsonW. H.于1953年发现自然健康土壤可以在一定 程度上控制土壤真菌(特别是病原真菌)的生长与繁殖，即具备真菌拮抗 功能。自然健康土壤的这种真菌拮抗功能与土壤微生物参与的碳-氮循环等 功能一样，是土壤质量和生物学功能的又一重要生物学指标，对抑制农作 物土传病害具有积极的生态学意义，目前正受到全世界土壤学家和土壤微 生物学家的广泛关注。关于土壤真菌拮抗功能作用机理共有七种假说，包括(1)抗真菌抗生 素假说；(2) Fe离子鳌合竟争假说；(3)氰化物毒性假说；(4)细胞壁降 解酶作用假说；(5)对代谢底物的营养竟争假说；(6)生态占位假说；(7) 微生物寄生或偏害共生假说，其中抗生素假说得到了广泛认可。目前已经 分离到一些可以抑制真菌生长的微生物菌株，包括细菌、真菌和放线菌等， 其中一些细菌已经用于生物控制土传植物病原真菌，如荧光假单胞菌M18。 但是自然土壤中还存在很多未知抑真菌微生物以及它们分泌的化学物质， 同时，DeB0er ( 2007 )等发现某些单独无真菌拮抗功能的细菌混合培养物 却可以很好地抑制真菌生长，而之前更有研究表明非拮抗微生物的存在可 以导致拮抗微生物的抗真菌抗生素产量增加。因此，土壤真菌拮抗不仅是 某些抑真菌微生物特有的功能，更是整个土壤微生物群落结构共同作用的 结果。口 土壤微生物群落结构的变化以及某些特殊抗真菌微生物的存在对于土 壤真菌拮抗功能有着决定性的意义，研究微生物群落组成及锁定抗真菌微 生物对于揭示土壤真菌拮抗功能至关重要。许多外界环境因素，如土壤类 型、肥料、耕作方式以及作物的种类等都可以影响土壤微生物群落结构。 连耕地和不耕地中土壤微生物多样性以及群落结构有很大的区别，不同植 被类型土壤中微生物群落组成也有很大差异，如种植小麦和种植玉米的农 田土中均有其特有的优势种群。在这些影响因素存在的情况下很难研究真 菌拮抗功能的真正影响因素。而在实际实验中，几乎找不到这些背景资料(即土壤类型、耕作方式、作物种类、肥力水平等)完全相同，但是土壤 真菌拮抗功能有差异的土壤样品
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。 为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下土壤真菌拮抗模型的构建方法将采集的土样高压高温，建立土壤抑真菌能力逐渐降低的土壤真菌拮抗模型，通过如下步骤进行构建1) 采集土壤样品；2) 高压高温处理土壤样品；3) 检测真菌拮抗功能；所述步骤l)中的土壤样品为无植物病害的土壤；所述步骤2)将土壤 样品分4份，l份为未处理的空白对照，另外3份分别在高压灭菌锅内100 。C、 ll(TC和121匸处理4min;所述步骤3 )将高温高压处理后的土样分别 接入禾谷镰刀菌FusaWuffl grafflinearira的琼脂糖菌丝块，在25_28"培养 3-5天后检测菌丝直径，通过检测菌丝直径即得到土壤抑真菌能力逐渐降低 的土壤真菌拮抗模型。所述步骤l)中土壤样品通过叉花式釆样法进行样品采集。本专利技术所具有的优点1. 模型构建方法简便可行 一般实验室均可搡作，且耗时短。2. 应用面广该模型可应用于不同土壤样品，研究不同土壤的真菌拮 抗功能及发现土壤特异的抑真菌微生物；不仅可以研究土壤细菌群落结构， 还可以研究真菌以及放线菌等其它微生物的群落结构组成与真菌拮抗功能 的关系。3. 本方法可以不考虑以上几种因素的影响，只釆取一个清洁土壤样品 (即无真菌病害发生)，用不同的温度处理可使得其真菌拮抗功能逐渐下降。研究这些处理后的样品中微生物群落结构和组成的变化就可以找出土 壤真菌拮抗功能的关键菌群。 附图说明图1为本专利技术各处理土壤样品真菌拮抗功能图。图2不同真菌拮抗能力土壤的细菌组成UPGMA聚类图。图标为土壤样 品间遗传距离。对照为自然土壤，样品1、 2、 3分别为10(TC、 ll(TC、 121 。C处理4 min土壤样品。具体实施例方式实施例1土壤真菌拮抗模型的构建土壤真菌拮抗模型的构建方法将采集的土样高压高温，建立土壤抑 真菌能力逐渐降低的土壤真菌拮抗模型，通过如下步骤进行构建1) 釆集土壤样品；2) 高压高温处理土壤样品；3) 检测真菌拮抗功能；所述步骤l)中的土壤样品为无植物病害的土壤；所述步骤2)将土壤 样品分4份，l份为未处理的空白对照，另外3份分别在高压灭菌锅内100 。C、 ll(TC和12rC处理4min;所述步骤3 )将高温高压处理后的土样分别接入禾谷镰刀菌Fusar!'iM graffl!'加ar咖的琼脂糖菌丝块，在25-28。C培养 3-5天后检测菌丝直径，通过检测菌丝直径即得到土壤抑真菌能力逐渐降低 的土壤真菌拮抗模型。釆取叉花式釆样法从中国科学院沈阳生态实验站釆集近十年未受农药 和肥料影响的自然荒地土壤，分别釆集0-20cm表层土壤，充分混匀，过 2mm筛子后分成四份，其中一份为空白对照，另外3份每份设3个重复，每 个重复称取40g土壤于培养皿中，分别于高压灭菌锅内IO(TC、 ll(TC以及 12rC处理4min。从已培养好禾谷镰刀菌Fusari咖gra/n&ear咖PDA平板 边缘取直径为0.8cm菌丝体生长旺盛的圆形琼脂糖块置于已处理土壤的中 央，然后于2Sr避光培养三天，测量菌丝体扩散生长圈直径大小，并根据 真菌菌丝生长相对抑制率建立具有高、中、低和极低真菌拮抗功能的土壤 模型(参见图1)。将高拮抗能力土壤对真菌生长的抑制率设为1,而极低 拮抗能力土壤的真菌生长抑制率设为0,用以下公式来计算其它两种土壤的 真菌生长相对抑制率真菌生长相对抑制率-l- (Dn-DO) / (Dl _D0) x簡式中Dn代表土壤中真菌生长圈直径，D0和D1分别为极低拮抗能力和 高拮抗能力土壤中真菌生长圈直径。高、中、低和极低拮抗能力土壤的真菌生长抑制率分别为1， 74%， 49%,0。验证土壤真菌拮抗模型的拮抗能力1) 土壤微生物基因组总DM的提取釆用FastPr印DNA提取仪及试 剂盒(Bio-101, Thermo)对处理后具不同真菌拮抗能力的土壤进行总MA提取，按说明书进行具体操作。2) 细菌16S rDNA片段的扩增与克隆文库的构建用细菌16S rDNA通 用引物 27F 5 ，—AGAGTTTGATCATGGCTCAG—3 ) 和 1492R ( 5 ，-GGTTACCTTGTTACGACTT -3，)对土壤微生物基因组总DNA进行PCR扩增， 获得全长约为1.5Kb的产物。PCR产物在0.8%的琼脂糖凝胶电泳后，利用 DNA胶纯化试剂盒(DV805A , TaKaRa,大连)回收。纯化后的PCR产物与 pMD19-T载体连接，转化E. coh' JM109感受态细胞，在含有IPTG和X-gal 的LB (含lOOmg/L Amp)平板上进行蓝白斑筛选，挑取阳性克隆子，建立 16S rDNA克隆文库。3) 16S rDNA的RFLP分析用载体引物M13-47重新扩增阳性克隆子中 插入的16S rDNA片段，PCR产物先后用限制性内切酶r叫I (65°C， 12hr ) 和/7i/2fl (37°C, 12hr)消化。取8 p 1酶切产物进行聚丙烯酰胺凝本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种土壤真菌拮抗模型的构建方法，其特征在于：将采集的土样高压高温，建立土壤抑真菌能力逐渐降低的土壤真菌拮抗模型，通过如下步骤进行构建：　１）采集土壤样品；　２）高压高温处理土壤样品；　３）检测真菌拮抗功能；　所述步骤 １）中的土壤样品为无植物病害的土壤；所述步骤２）将土壤样品分４份，１份为未处理的空白对照，另外３份分别在高压灭菌锅内１００℃、１１０℃和１２１℃处理４ｍｉｎ；所述步骤３）将高温高压处理后的土样分别接入禾谷镰刀菌Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｇｒａｍｉ ｎｅａｒｕｍ的琼脂糖菌丝块，在２５－２８℃培养３－５天后检测菌丝直径，通过检测菌丝直径即得到土壤抑真菌能力逐渐降低的土壤真菌拮抗模型。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张惠文，吴敏娜，李旭，李新宇，苏振成，张成刚，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]