一种适用于盐酸西布曲明的免疫原合成方法，属于生物化工技术领域。本发明专利技术以盐酸西布曲明代谢物双去甲基盐酸西布曲明Ｍ２为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白牛血清白蛋白ＢＳＡ偶联，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外扫描仪测定偶联物的偶联比。本发明专利技术是一种季胺类减肥药物的通用人工抗原的合成方法，合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了必需的人工抗原，可以满足国内对其研究的需要。
【技术实现步骤摘要】
，涉及一种减肥药类药物的人 工抗原的合成方法，属于生物化工
技术介绍
盐酸西布曲明，英文名称Sibutramine Hydrochloride,其化学名称为 (士)N-U--3-甲基丁基卜N，N-二甲胺盐酸盐一水合 物，CAS号106650-56-0，分子式是C17H26C1N'HC1'H20，是西布曲明的盐酸盐 水合物。本品由德国Kno 11公司研制，该药于1997年ll月获美国FDA批准 在美国上市；2000年5月该药获国家药品监督管理局(SDA)批准在中国上市， 用于治疗肥胖症。盐酸西布曲明为口服中枢作用的减肥药，它口服迅速被吸收， 经肝脏首过效应，被肝脏的细胞色素P450 3A4同工酶代谢为两种活性产物，即 单去甲基西布曲明(仲胺类，Ml)和双去甲基西布曲明(伯胺类，M2)而产生作 用。西布曲明体内代谢产物的主要作用机制是抑制去甲肾上腺素、5-羟色胺和多 巴胺的再摄取，增加突触间隙去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的浓度，引起食 欲中枢饱胀感增强，产热量增加；而对去甲肾上腺素、5-羟色胺和多巴胺的释放 无明显影响。研究还表明，西布曲明及其胺类活性代谢产物无明显抗胆碱、抗 组胺和单胺氧化酶抑制作用。适用于运动及饮食控制仍不能减轻的肥胖症。西 布曲明常见的消化系统不良反应主要有口干、厌食和便秘，还有少见的消化系 统不良反应为腹泻、胃肠炎和味觉异常，发生率一般<1%，偶有肝和肾损害的报 道。西布曲明具有升高血压和加快心率的作用，它的神经系统不良反应有失眠、 头痛、头昏、头晕等，也可有感觉异常、肢体痉挛、张力增加、思维异常、癫 痫发作。2002年12月后，"药健"批准文号被取消，保健品从此分流成药品和 食品。"曲美"、"赛尼可"等以化学药物成分为主的减肥保健品成为受到严 格监管的药品，而以食品为主要成分的减肥保健品则成为了保健食品。目前， 我国减肥保健食品面临两个主要问题， 一是虚假、夸大宣传，二是添加违禁药 物。针对减肥市场上的保健减肥食品夸大、虚假宣传问题，国家有关部门给予 了高度重视，并加大了执法力度， 一批有夸大、虚假宣传的问题被集中曝光。 然而相对于夸大宣传，在食品中添加一些药物及其结构改造物，此类违禁添加情 况隐蔽，它不仅违反了食品卫生法规，而且由于消费者对食品、保健品安全性 的信赖，不加限制地服用此类食品、保健品，对其健康的危害极大。对于这种 违禁添加行为的监督和控制在技术上就显得比较困难。因大部分监督检验部门缺乏相应的检验方法和标准品，难以对产品中的该成分进行确证的检验，使得 产品添加违禁药物情况难以査处。现今盐酸西布曲明主要的分析方法有高效液相色谱法、毛细管电泳法、LC-MS、 LC-MS/MS、 GC/MS、衍生化荧光分光 光度法、紫外光谱法及薄层色谱法等。现有的仪器检测法虽然有灵敏度高、适 用范围广等优点，但是样品前处理复杂，所需的仪器昂贵，成本高，检测时间 长，因此有必要研究特异性强，灵敏度高同时价格低廉，能快速简便的免疫检 测技术。这就需要合成能产生簇特异性抗体的免疫原。目前为止，国内外尚没 有针对盐酸西布曲明结构多残留的免疫检测方法的报道，为此设计合成了以盐 酸西布曲明的代谢物双去甲基盐酸西布曲明M2为半抗原的用于盐酸西布曲明 结构检测的完全抗原。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种减肥药类药物通用人工抗原的合成方法，所制备 的产品用于盐酸西布曲明结构的免疫分析方法研究。为今后人们的研究提供了 更好的必需的人工抗原。本专利技术的技术方案 ，以盐酸西布曲明代谢物双去甲基盐酸西布曲明M2为半抗原,用混合酸酐法将其与载体 蛋白牛血清白蛋白BSA偶联，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外扫描仪 (UNICO,UV-2802pcs)测定偶联物的偶联比；(1) 人工抗原的合成双去甲基盐酸西布曲明、三丁胺、氯甲酸异丁酯、牛血清白蛋白以摩尔比为44 : 53 : 53 : 1的比例反应，双去甲基盐酸西布曲明 溶于丁二酸酐的吡啶溶液中，常温下避光搅拌23小时后用氮气吹干，再加N，N-二甲基甲酰胺DMF : 1，4-二氧六环体积比1 : 1的溶剂溶解后，加入三丁胺在冰 水中搅拌，最后加入氯甲酸异丁酯室温搅拌反应lh，为A液；牛血清白蛋白溶 于硼酸纳缓冲溶液中后逐滴加入上述A液中，室温下搅拌反应24h，即得人工 抗原混合液；透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用60。C的去离 子水冲洗3min，保存在4'C去离子水中备用；将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的pH7.4的磷酸盐缓 冲溶液和2X2L的去离子水透析3天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成 粉末，即得到人工抗原双去甲基盐酸西布曲明-牛血清蛋白；(2) 人工抗原的鉴定双去甲基盐酸西布曲明-牛血清蛋白采用聚丙烯酰胺 凝胶电泳测定其偶联比。本专利技术的有益效果本专利技术成功合成了双去甲基盐酸西布曲明的人工抗原， 合成步骤简洁，有效，完全可用于免疫分析中，为以后人们的研究提供了方便 的途径，可以满足国内对其研究的需要。附图说明图1 BSA及M2-BSA偶联物的紫外扫描组合图。 图2双去甲基盐酸西布曲明-BSA等的电泳图。具体实施方式 实施例1(1) 人工抗原的制备20mg(0.06627mmo1)双去甲基盐酸西布曲明溶液溶于1.5mL溶解有8mg (0.08mmol)丁二酸酐的吡啶溶液中，然后常温下避光搅拌23小时后用氮气吹干， 再加N,N-二甲基甲酰胺DMF : 1，4-二氧六环=1 : 1的溶剂1.2mL充分溶解后， 加入2L2iiL(0.08mmol)三丁胺在冰水中搅拌10分钟，再加入12|nL (0.08mmol) 氯甲酸异丁酯室温搅拌反应lh，为A液。称取100mg (0.00151mmo1)牛血清 白蛋白溶于5.8mLpH8.5的硼酸纳缓冲溶液中，低温中保存，此液为B液。在 低速搅拌下，在冰水中将活化的A液逐滴加入到B液中搅拌，滴完后转入室温 下搅拌反应24h，离心去掉沉淀，取上清液即得人工抗原混合液。透析袋前处理取10cm的透析袋，于沸水中煮沸5min，再用6(TC的去离 子水冲洗3min，保存在4"C去离子水中备用。将人工抗原混合液移入透析袋中，用2X2L的0.01M的PBS溶液和2X2L 的去离子水透析3天。最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人 工抗原M2-牛血清蛋白。(2) 双去甲基盐酸西布曲明人工抗原的鉴定偶联比测定估算偶联物中被偶联的两种分子的比率(偶联比率) 的方法，虽然种类很多，但都是依据检测偶联物中被偶联的两种分子含 量(或相对含量)的原理建立起来的.凝胶电泳法是依据合成的人工抗 原的分子量来鉴定合成的人工抗原。SDS-聚丙烯酰胺电泳利用迁移率只 与分子量有关，而与所带电荷、分子形状无关，可以利用SDS-聚丙烯酰 胺电泳来确定人工抗原的分子量从而确定偶联比。本实验采用10%的分 离胶，5%的压縮胶，对低分子量人血清白蛋白HSA、牛血清蛋白BSA、 偶联物M2-BSA进行电泳鉴定。利用FR980生物电泳凝胶成像系统软件 得出偶联比r-13。即人工抗原的形式完全符合免疫要求。偶联物蛋白浓度测定配制浓度为0， 40， 60， 80， 100， 120， 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适用于盐酸西布曲明的免疫原合成方法，其特征是以盐酸西布曲明代谢物双去甲基盐酸西布曲明Ｍ２为半抗原，用混合酸酐法将其与载体蛋白牛血清白蛋白ＢＳＡ偶联，用聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外扫描仪测定偶联物的偶联比； （１）人工抗原的合成：双去甲 基盐酸西布曲明、三丁胺、氯甲酸异丁酯、牛血清白蛋白以摩尔比为４４∶５３∶５３∶１的比例反应，双去甲基盐酸西布曲明溶于丁二酸酐的吡啶溶液中，常温下避光搅拌２３小时后用氮气吹干，再加Ｎ，Ｎ－二甲基甲酰胺ＤＭＦ∶１，４－二氧六环体积比１∶１的溶剂溶解后，加入三丁胺在冰水中搅拌，最后加入氯甲酸异丁酯室温搅拌反应１ｈ，为Ａ液；牛血清白蛋白溶于硼酸纳缓冲溶液中后逐滴加入上述Ａ液中，室温下搅拌反应２４ｈ，即得人工抗原混合液； 透析袋前处理：取１０ｃｍ的透析袋，于沸水中煮沸５ｍｉｎ，再 用６０℃的去离子水冲洗３ｍｉｎ，保存在４℃去离子水中备用； 将人工抗原混合液移入透析袋中，用２×２Ｌ的０．０１Ｍ的ｐＨ７．４的磷酸盐缓冲溶液和２×２Ｌ的去离子水透析３天，最后使用冻干法将透析袋中的液体制成粉末，即得到人工抗原：双去甲基 盐酸西布曲明－牛血清蛋白； （２）人工抗原的鉴定：双去甲基盐酸西布曲明－牛血清蛋白采用聚丙烯酰胺凝胶电泳和紫外扫描仪测定其偶联比。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，李灼坤，马伟，徐丽广，谢会玲，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：32[中国|江苏]
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