检测水产品食物过敏原基因的实时荧光PCR方法技术

本发明专利技术公开了一种检测水产品食物过敏原基因的实时荧光ＰＣＲ方法，其步骤包括提取样品总ＲＮＡ，通过ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ或ＴａｑＭａｎ探针法实时荧光ＰＣＲ技术分别检测水产品食物过敏原基因Ｐａｒ和ＴＭ，以及内标基因β－ａｃｔｉｎ，依据扩增动力学曲线和Ｃｔ值对检样进行结果分析。由于本发明专利技术利用实时荧光ＰＣＲ技术来检测水产品食物过敏原基因Ｐａｒ和ＴＭ，相对于其它方法，该技术具有灵敏度高、检测时间短和可以定量分析等优点，可用于水产品的未知品种或混合样品中过敏原基因的定性筛选、定量分析和确认鉴定。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及食物过敏原基因的检测，特别是涉及检一种检测水产 品食物过敏原基因的实时荧光聚合酶链式反应(PCR)方法，该方法 主要用于鱼类小清蛋白(Par)和甲壳类原肌球蛋白'(TM)基因的实 时荧光PCR检测。
技术介绍
食物过敏医学上也称变态反应。引起食物过敏反应的物质叫做食 物过敏原，如鱼、虾、蟹、牛奶、蛋类等。其反应机理为过敏原进入 机体以后，会导致机体发生正常或过度免疫应答，即超敏反应。当再 次接触相同过敏原时多个IgE分子和抗体结合，引起IgE的Fc端结 构改变，导致细胞脱颗粒，释放组胺、5-羟色胺、白三烯等生物呼吸 活性物质并作用于效应器官，表现为平滑肌收縮、毛细血管扩张、通 透性增加、皮肤过敏、呼吸道过敏、造血系统过敏甚至过敏性休克(赵 俊芳，等.食物过敏原检测及其应用前景.中华检验医学杂志，2007， 8: 948-950)。近年来食物过敏问题已引起广大消费者、食品生产者和科学研究 者的普遍关注。根据流行病学调査，全球约有2%-2. 5%的成人受到食 物过敏疾病的困扰，婴幼儿的发病率更高，达到4%-6%，儿童约为 2%-3%。在联合国粮农组织公布的全球八大类过敏食物中，鱼类和甲 壳类水产品是其中重要的两大类，其主要过敏原分别为鱼类小清蛋白 (Par)和甲壳类原肌球蛋白(TM) (Food and Agriculture Organization. Report of the FAO technical consultation on foodallergies. Rome, Italy. 1995.)。对于食物过敏目前无特别的治疗方法，严格避免接触过敏食物是 最有效的方法。常用的检测过敏原方法有体内过敏原点刺试验、体外 检测特异性IgE (RAST抑制实验和EAST抑制实验)、双盲食物激发 试验和酶联免疫吸附试验等。这些方法中，体内过敏原点刺试验易出 现假阳性；RAST抑制实验和EAST抑制实验的不足是对人体血清的依 赖性，血清是很难保证一致的，因此该方法难以标准化；双盲食物激 发试验易受其它因素影响，实践中也不易操作，实验剂量、安慰剂及 双盲控制等环节还有待完善；酶联免疫吸附试验对于微量蛋白难以检 测(赵俊芳，等.食物过敏原检测及其应用前景.中华检验医学杂志， 2007， 8: 948-950)。近年来基因检测方法(如PCR、核酸杂交)以其敏感性高、特异 性好、操作简便而倍受检验工作者的青睐。但是常用的PCR检测技术 仍需经历一个对扩增产物进行电泳分析的过程，时间耗费在所难免， 而且电泳过程中所使用的溴化乙啶染料对人和环境都有不同程度的 危害 (Lee C Y, et aL Detection of pathogenic bacteria in shellfish using multiplex PCR followed by CovaLink NH microwell plate sandwich hybridization. Journal of Microbiology Methods, 2003， 53: 199-209)。实时荧光PCR的扩增与产物分析全过程均在 单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR检测进行实时 监测和自动分析的目标，也从根本上解决了常规PCR可能发生的假阳 性污染问题。但目前尚无采用实时荧光PCR方法来检测水产品食物过 敏原基因，因此，公众迫切需要将水产品食物过敏原基因检测方法应 用于实践
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可定量、快速、灵敏检出水产品食物过敏原的实时荧光PCR方法。为实现上述目的，本专利技术的技术解决方案是提取样品总RNA， 通过SYBR Green或TaqMan探针法实时荧光PCR技术分别检测水产品 食物过敏原基因Par和TM，以及内标基因P-actin，依据扩增动力 学曲线和Ct值对检样进行结果分析。本专利技术具体包括以下步骤-(1) 设计合成用于检测水产品食物过敏原的3组引物及探针。 Par基因的上游引物5， -ATGGCATTCGCTGGAATTCTG-3'， Par基因的下游引物5， -TGCCATTTATGCCTTGACCAG-3'，Par基因的探针5， -FAM-AGGGCTGCCAAGCTGCTGACTCC-TAMRA-3，； TM基因的上游引物，TM-1: 5， -CGCATGGACGCCATCAAGAAGAAGATG -3，，TM基因的上游引物5， -AGGTTMTAGCCAGACAGTTCGCT-3，， TM基因的探针5， -FAM-AGCAGCTGTCCGCCGCTAACACTAAG -TAMRA-3，；actin基因的上游引物5， -AGAGCAAGAGAGGTATCTTGA-3，， actin基因的上游引物5， -GGCGGTCTCGTGGATACCAG-3，， actin基因的探针5' -FAM- CACGGCATCATCACTAACTGGGACGA -TAMRA-3'。(2) 实时荧光PCR检测。配制荧光PCR扩增反应体系，体系含有 PCR缓冲液、MgCl2、 dNTP、逆转录酶、RNase抑制剂,DNA聚合酶、 上游引物和下游引物、Oligo dT15、 RNA模板、灭菌超纯水(注探 针法需添加TaqMan探针)；荧光PCR扩增反应条件为45_55匸逆转 录20-40min; 93-95。C预变性3—lOmin; 93-95°C/30-60S， 50_60°C/30-60S， 72°C/40-90S， 35-45循环(注:采用SYBR Green法需设 置6(TC到95-C的熔解曲线分析)；检测设立阳性对照(水产品肌肉 总RNA)、阴性对照(猪肉总RNA)和空白对照(灭菌超纯水)。反 应结束后，依据荧光PCR仪器的分析软件，求出每个样品的Ct值， 依据Ct值和扩增动力学曲线对检样进行分析。本专利技术可以制成用于检测水产品食物过敏原基因的实时荧光PCR 试剂盒。由于本专利技术采用SYBR Green或TaqMan探针法实时荧光PCR检测 水产品食物过敏原基因。SYBR Green是一种与DNA双链结合的荧光 染料，当与DNA双链结合时发出荧光；当DNA解链时，SYBR Green 被释放出来，荧光信号急剧减弱，反应体系中荧光信号强度代表了双 链DNA分子的数量；但SYBR Green染料能与所有DNA双链结合，因 此必须设置熔解曲线来分析扩增产物的特异性(即目标核酸序列的熔 解温度，Tm) 。 TaqMan探针是一种能与PCR产物杂交的寡核苷酸探 针，探针两端分别标记荧光报告基团和淬灭基团；探针完整时，报告 基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，DNA聚合酶的外 切酶活性将探针降解，破坏了两个荧光分子之间的能量传递，从而发 出荧光；切割下来的荧光分子数与PCR产物的数量成正比，即荧光信 号的累积与PCR产物形成完全同步(Ke L D， et al. A reliability test of standard-based quantitative PCR - exogenous vs endogenous standards. Molecular and Cellular Prob本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测水产品食物过敏原基因的实时荧光ＰＣＲ方法，其特征在于：其步骤包括提取样品总ＲＮＡ，通过ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ或ＴａｑＭａｎ探针法实时荧光ＰＣＲ技术分别检测水产品食物过敏原鱼类小清蛋白（Ｐａｒ）和甲壳类原肌球蛋白（ＴＭ）基因，以及内标 基因β－ａｃｔｉｎ，依据扩增动力学曲线和Ｃｔ值对检样进行结果分析。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘光明，曹敏杰，蔡慧农，
申请(专利权)人：集美大学，
类型：发明
国别省市：92[中国|厦门]