人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用定量检测法制造技术

本发明专利技术公开的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用定量检测法，其特征在于包括：采用同位素稀释技术，在尿样的预处理时分别加入含１３Ｃ３；１５Ｎ３－三聚氰胺或氘代三聚氰胺和１３Ｃ３；１５Ｎ３－三聚氰酸的内标溶液；液－液萃取法分别提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；建立ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ方法分别定量检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸浓度，液相色谱以苯基、氟苯基、硅胶等填料柱为固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液为流动相，色谱分离进行等度洗脱或梯度洗脱，质谱检测采用电喷雾电离源（ＥＳＩ）检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限可达１０ｎｇ／ｍｌ。本方法的样品处理经济、简便，检测专一性强、灵敏度高，各项方法学指标均能达到中国药典的相关技术要求。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药检测
，具体涉及人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质 联用(液相色谱串联质谱技术)定量检测方法。
技术介绍
三聚氰胺(Melamine, 2 ， 4 ， 6-三氨基-1, 3, 5-三嗪)，是一种三嗪类含氮杂 环有机化合物，分子式C3N3(NH2h，分子量126.12。结构式为H。N N NH三聚氰胺遇强酸或强碱水溶液水解，胺基逐步被羟基取代，先生成三聚氰酸 -酰胺，进一步水解生成三聚氰酸一酰胺，最后生成三聚氰酸HO由于蛋白质主要由氨基酸组成，其含氮量一般不超过30%，而三聚氰胺的分 子式(C3N6H6)含氮量为66.7%。现阶段通用的蛋白质测试方法"凯氏定氮法"， 是通过测出含氮量来估算蛋白质含量，因此，不法分子在食品中添加三聚氰胺使 得食品的蛋白质测试含量上升。1978年Newton和UUey发现三聚氰胺具有这种 作用，近期曝光的三鹿婴幼儿奶粉中含有大量三聚氰胺也是基于同样的缘由。毒性学研究表明三聚氰胺在体内的毒性非常微弱，大鼠口服的LD5Q(半数致 死量)为3161mg/kg。 1994年国际化学品安全规划署和欧洲联盟委员会合编的《国际化学品安全手册》第三巻和国际化学品安全卡片指出长期或反复大量摄入三 聚氰胺可能对肾与膀胱产生影响，导致产生结石。动物实验表明三聚氰胺在尿内 形成草酸钙结晶，与泌尿系统结石有明显的关联性，并可引起肾功能衰竭，导致动物死；近期在我国所发生婴儿死亡事件也支持这种观点。据报道，三聚氰胺在不同物种中代谢存在差异。其在猪体内的其半衰期大约 为4.04土0.37h，是老鼠体内(2.71h)的1. 5倍，其原因为老鼠的肾脏清除率 是猪的5倍。三聚氰胺在体内的清除机制并不明确，但是根据其作为极性小分子 的理化性质，以及猪体内的清除率(27ml/min)和肾小球滤过率(31-42 ml/min), 可以认为主要经肾脏清除。雄性Fischer大鼠的毒代研究表明，24h 90%的口服 剂量在尿中清除，28小时已经超过99%，肾脏和膀胱中三聚氰胺的量髙于其他组 织。体内清除速度如此之快，说明三聚氰胺可能很少在体内聚集。动物实验研究 表明，在猪体内三聚氰胺的表观分部容积为0.61(±0.04)L/kg，接近体液的总 量，故推测三聚氰胺在猪体内主要分布于细胞外液，大部分器官组织中并不存在。 现有的文献资料表明，三聚氰胺在不同的哺乳动物中的代谢特征有较大的差异； 有关三聚氰胺在人体的代谢情况尚未见报道。目前常见的三聚氰胺检测方法有髙效液相色谱法(HPLC法)、反相HPLC法、 液相色谱串联质谱法、气相色谱质谱联用法、升华法、离子交换色谱-紫外检测 法。样品来源主要为动物食品、饲料、乳制品。样品处理方法多需固相萃取、过 滤、衍生化处理等步骤，测定方法中均未见同位素内标的使用。2008年9月媒体报道三鹿婴幼儿奶粉中检测出三聚氰胺，并导致食用该奶 粉的婴幼儿发生肾结石的重大食品安全事件，引起了全社会的关注。建立可靠灵 敏的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)定量检测方 法，以便能及时了解人体内三聚氰胺的残留情况、临床跟踪观察并采取有效的诊 疗措施等，均具有十分重大的临床意义。有关三聚氰胺和三聚氟酸在人尿中的检测方法尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题，在于利用液相色谱-串联质谱和同位素稀释质 谱原理，为临床提供一种搡作简便、专一灵敏的临床人尿中三聚氰胺和三聚氰酸 定量检测方法，以满足临床的需求。本专利技术公开的定量检测的方法包括釆用同位素稀释技术，在尿样的预处 理时分别加入含13C3; 15N3-三聚氰胺或氘代三聚氰胺和13C3; 15N3-三聚氰酸的 内标溶液；液-液萃取法分别提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；建立LC-MS/MS方法 分别定量检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸浓度，液相色谱以苯基、氟苯基、硅胶等填料柱为固定相，甲醇、乙腈、水、甲酸溶液或混合液为流动相，色谱分离进 行等度洗脱或梯度洗脱，质谱检测采用电喷雾电离源(ESI)检测人尿中三聚氰 胺和三聚氰酸含量。三聚氰胺和三聚氰酸的最低定量限可达IO ng/ml。 本专利技术方法包括以下步骤1、 样品预处理根据三聚氰胺和三聚氰酸的酸碱性质，采用液-液萃取的样品预处理方法分 别处理三聚氰胺和三聚氰酸样品。三聚氰胺用氢氧化钠或氨水碱化，液-液萃取 所用的提取溶剂为乙酸乙酯。三聚氟酸用甲酸酸化，液-液萃取所用的提取溶剂 为异丙醇、乙酸乙酯或者二者的混合溶剂。2、 液相分离三聚氰胺和三聚氰酸分别进行液相色谱分离(1) 流动相由A和B组成，流速为0.2-0. 5ml，其中A为含0. 0001 ~ 0. 1% 甲酸水溶液，B为含0. 0001 ~ 0. 1%甲酸的甲醇或乙腈或甲醇和乙腈的混合液。(2) 色谱柱采用苯基、氟苯基、氰基、硅胶等填料柱，色谱柱内径为1 5rnrn， 长度为50~ 250mm (3) 洗脱方法采用等度或梯度洗脱方式。釆用等度洗脱时，流动相A为0.02y。 甲酸水，流动相B为含O. 02%甲酸的体积比为1 : 1的甲醇和乙腈溶液，A:B为体 积比(20 - 50 ): (80~50)。采用梯度洗脱时，流动相A:甲醇(含0. 001%甲酸)， 流动相B:水，梯度比例A为10 ~ 100%， B为0~90%。使用色谱柱为XbridgeTM Phenyl (150x2. lmm， 5 jum， Waters),梯度程序可参考表1;流速0. 35ml/min。表l流动相梯度程序表<table>table see original document page 5</column></row><table>3、质谱检测三聚氰胺釆用电喷雾电离源(ESI)，正离子多反应监测扫描(MRM)，离 子选择通道(Ql/Q3):三聚氰胺m/z 127 / 68 (定量)和127 / 85 (定性)，内标通道为13C3; 15N3-三聚氰胺m/z 133/72。离子通道范围可为土l.O amu。三聚氰酸采用电喷雾电离源(ESI),负离子多反应监测扫描(MRM)，离子选择通道(Ql/Q3 ): ra/z 128 / 42 (定量)和128 / 85 (定性)，内标13C3; 15N3-三聚氰酸m/z 134/44。离子通道范围可为土l.O amu。4、浓度计算方法和检测限按内标法以峰面积或峰高法，分别计算尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量。 本专利技术三聚氰胺和三聚氰酸的检测限为lng/ml，定量范围为10 - 5000ng/ml，线性相关系数0. 9990以上，批内、批间精密度小于10°/。，准确度85-115%之间。样品稳定性良好。本专利技术的有益结果是1. 根据三聚氰胺和三聚氰酸不同的理化性质，本专利技术分别对其进行样品处 理、色谱分离和质谱检测。建立了相对经济简便的人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的 预处理方法。本研究采用了液液萃取的样品预处理方法，在满足方法学各项指标 的前提下，与已有的固相萃取方法相比，更为快速、简便和经济。2. 采用同位素稀释法定量，在尿样的预处理时就加入三聚氰胺和三聚氰酸稳 定同位素内标，实现了对测试的全过程的跟踪校正，确保测定结果的准确可靠。3. 本本文档来自技高网...

【技术保护点】
人尿中三聚氰胺和三聚氰酸的液质联用定量检测法，其特征在于，以同位素稀释法定量，在尿样的预处理时加入含三聚氰胺和三聚氰酸稳定同位素的内标溶液；液－液萃取法分别提取尿中三聚氰胺和三聚氰酸；液相色谱串联质谱技术检测人尿中三聚氰胺和三聚氰酸含量；按内标法以峰面积或峰高法，计算尿中三聚氰胺和三聚氰酸的浓度。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：朱建民，余琛，何健，刘罡一，高淳新，陆川，张梦琪，李水军，戴方，刘昀，周菊珍，宋晓涛，贾晶莹，刘艳梅，周红，
申请(专利权)人：上海市徐汇区中心医院，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]