本发明专利技术公开了一种水产品中恩诺沙星残留的一步式免疫检测方法，该方法利用生物免疫技术制备特异性多克隆抗体；将制备的特异性抗体与辣根过氧化物酶结合形成酶标记抗体；以９６孔聚苯乙烯板为固相载体，事先以相应的完全抗原进行包被、载体蛋白进行封闭；检测时同时以不含有待测物的提取液制备阴性对照，以恩诺沙星标准品的梯度溶液建立标准曲线；利用常规ＥＬＩＳＡ检测其吸光值并计算相应的抑制率，进而根据标准曲线测定样品中待测物的浓度。本发明专利技术灵敏度高、准确性好，可以满足相关标准的检测要求；操作简便快速，有效缩短了分析时间，可应用于恩诺沙星残留的现场快速筛选检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测水产品中药物残留的方法，具体地说是涉及一种检测恩诺沙星 残留的方法。本专利技术由国家自然科学基金项目(No. 30400336)及国家农业行业科研专 项(NYHYZX 07-046)资助完成。
技术介绍
恩诺沙星(Enrofloxacin)是一种化学合成的广谱抗菌药物，属于氟喹诺酮类药物的 代表产品，目前广泛用于水产养殖领域细菌感染性动物疾病的治疗和控制。然而越来越 多的研究表明恩诺沙星对人体健康存在潜在危害，相关检测和监控要求也愈加严格。恩 诺沙星的检测方法包括液相色谱及质谱一液相色谱联用和免疫检测方法等。而现有的免 疫检测方法以两步式酶联免疫吸附检测(ELISA)为主，该方法存在着检测时间长，操 作繁琐，抗千扰能力差等问题，从而限制了其作为快速筛选方法的实际应用。因此研究 一种更为简便快速的检测方法具有较高的学术价值和应用前景。
技术实现思路
针对传统ELISA检测存在的上述问题，本专利技术的目的是提供一种简便、快速的一 步式恩诺沙星残留的免疫检测方法。 本专利技术的目的通过以下步骤实现(1) 首先利用生物免疫技术制备恩诺沙星特异性多克隆抗体；(2) 以制备的特异性抗体与辣根过氧化物酶结合形成酶标记抗体；(3) 以96孔聚苯乙烯板为固相载体，包被相应完全抗原并进行封闭处理；(4) 对待测样品中的恩诺沙星残留进行分离提取；(5) 将样品提取液、酶标记抗体液同时加入96孔板中，进行反应后利用酶标仪测 定OD450值；(6) 同时以不含有待测物的提取液代替样品液作为阴性对照，以恩诺沙星标准品的 梯度稀释液代替样品液建立标准曲线；(7) 样品与阴性对照进行比较，弓|起吸光值降低10%以上即判断为阳性样品，即含有待测药物残留，否则为阴性样品；并根据恩诺沙星标准品的梯度曲线进行回 归分析测定待测样品中药物残留的浓度。与现有ELISA检测技术相比较，本专利技术的主要优点在于(1) 有效縮短了分析时间，操作更为简便快速， 一般可以在2小时内完成检测，明显 优于现有的ELISA检测方法；(2) 有效节约了反应使用的试剂，省却了引入酶标记二抗带来的繁琐操作；(3) 可以组装成改良的ELISA快速检测试剂盒，较传统试剂盒更为快速简便，适合大 量样品的快速筛选处理。具体实施例方式下面通过具体实施例来详细说明本专利技术。 实施例l:鳗鱼中恩诺沙星残留的快速检测 1、抗体的制备及纯化利用生物免疫技术免疫小鼠来制备恩诺沙星抗体，小鼠免疫后分离恩诺沙星抗血 清，以30—50%饱和度的硫酸铵沉淀粗纯后，进一步利用superdexTM75柱纯化。2 、酶标记抗体的制备称取5mg辣根过氧化物酶溶解于lml蒸馏水中，加入0.2mL新配的O. 1M NaIO4溶液， 室温下避光搅拌20分钟；溶液装入透析袋中，对lmM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4°C 过夜；取出后，加2(^L0.2MpH9.6碳酸盐缓冲液，使以上醛基化后的辣根过氧化物酶的 pH升高到9.0 9.6，然后立即加入溶解在lmL O.OIM碳酸盐缓冲液中的小鼠血清抗体 10mg，室温避光轻轻搅拌2小时；加0.1mL新配的4mg/ml NaBEU液，混匀，再置4'C搅 拌反应2小时；在搅拌下逐滴加入等体积的50%饱和度的硫酸铵，4'C静置1小时；3000rpm 4'C离心30min，弃上清，沉淀物溶于lmL0.01M PH7.4的PBS (含有O.l %吐温-20的磷酸 盐缓冲液)中，对0.01MpH7.4PBS透析，4。C过夜；次日取出后，10000rpm4'C离心30 分钟所得上清液即为酶结合物，分装冻存。3 、酶标板的包被与封闭用碳酸盐缓冲液(0.05 mol/L,pH 9.6， CBS)包被恩诺沙星完全抗原，每孔10(HiL， 4'C包被过夜；次日取出后，每孔加满磷酸盐一吐温洗液(PBST， O.OIM， pH7.4，含 0.1%tween-20)振荡洗漆3次，每次5min，甩干、滤纸上拍干；每孔加满0.1%卵清白蛋 白37'C封闭2h，如上洗涤3次。 4、样品前处理空白样品用电动匀浆机匀浆，准确称取5.0g匀浆后的样品，添加不同浓度的沙星标准品，加入5mL甲醇-PBS (1:1，V/V)混合提取液，于高速均质机处理2min， 4°〇下 以4000rpm离心10min，转移上清液；沉淀用同样方法重复处理一次，合并两次上清； 上清液再次以4。C10000rpm离心10min，弃去沉淀；上清液过0.22pm微孔滤膜，备用。 5、样品检测取50pL样品液与确定好工作浓度的酶标记抗体等体积混合，加到经封闭处理的酶 标板上，每个样品设置三个平行，同时以不加沙星的提取液为阴性对照，37i:反应90min， 取出后如上洗涤。每孔加入底物溶液100pL， 37'C密封反应20min，取出后用50juL2M H2S04终止反应，在酶标仪上读取OD450值。同时进行5个浓度梯度恩诺沙星标准品的 测定，实验结束后根据标准品检测结果绘制标准曲线，测定样品中恩诺沙星的浓度并进 行回收率及精密度的计算。检测结果如表l所示。目前国内外对于食品中恩诺沙星最低检出限一般要求在50|ag/kg以上。恩诺沙星加 标浓度为10 ng/mL ~ 40 ng/mL时，加标检测的平均回收率基本可以达到在70%以上， 同一检测重复三次的结果基本一致，相对平均偏差均<12%;这表明该方法的主要性能 如准确度、灵敏度和精密度完全可以满足实际检测的要求；检测时间在120分钟之内， 明显少于液相色谱检测技术，较现有酶联免疫检测技术(通常3小时以上)也更加快速； 操作较为简便，1张酶标板上可以同时进行多个样品的检测，非常适合于大量样品的定 性快速筛选检测。表1本专利技术方法用于鳗鱼肉样品中恩诺沙星检测的回收率和精密度恩诺沙星添加浓度 回收率 平均回收率 相对标准偏差(pg.kg-1) (%) (%) (%)10 86.23/95.05/95.98 92.42 5.8220 120.4/98.6/101.3 106.8 1U340 72.43/68.67/69.31 69.31 4.1权利要求1. ，其特征在于包括以下步骤(1)首先利用生物免疫技术制备恩诺沙星特异性多克隆抗体；(2)以制备的特异性抗体与辣根过氧化物酶结合形成酶标记抗体；(3)以96孔聚苯乙烯板为固相载体，包被相应完全抗原并进行封闭处理；(4)对待测样品中的恩诺沙星残留进行分离提取；(5)将样品提取液、酶标记抗体液同时加入96孔板中，进行反应后利用酶标仪测定OD450值；(6)同时以不含有待测物的提取液代替样品液作为阴性对照，以恩诺沙星标准品的梯度稀释液代替样品液建立标准曲线；(7)样品与阴性对照进行比较，引起吸光值降低10％以上即判断为阳性样品，即含有待测药物残留，否则为阴性样品；并根据恩诺沙星标准品的梯度曲线进行回归分析测定待测样品中药物残留的浓度。2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤(1)中是利用生物免疫技术免 疫小鼠来制备恩诺沙星抗体。3. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于未知样品中恩诺沙星药物在测定前需要 进行提取纯化。全文摘要本专利技术公开了，该方法利用生物免疫技术制备特异性多克隆抗体；将制备的特异性抗体与辣根过氧本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种水产品中恩诺沙星残留的一步式免疫检测方法，其特征在于包括以下步骤： （１）首先利用生物免疫技术制备恩诺沙星特异性多克隆抗体； （２）以制备的特异性抗体与辣根过氧化物酶结合形成酶标记抗体； （３）以９６孔聚苯乙烯板为固相 载体，包被相应完全抗原并进行封闭处理； （４）对待测样品中的恩诺沙星残留进行分离提取； （５）将样品提取液、酶标记抗体液同时加入９６孔板中，进行反应后利用酶标仪测定ＯＤ４５０值； （６）同时以不含有待测物的提取液代替样品液 作为阴性对照，以恩诺沙星标准品的梯度稀释液代替样品液建立标准曲线； （７）样品与阴性对照进行比较，引起吸光值降低１０％以上即判断为阳性样品，即含有待测药物残留，否则为阴性样品；并根据恩诺沙星标准品的梯度曲线进行回归分析测定待测样品中药 物残留的浓度。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：曹立民，林洪，李宗妍，隋建新，许旭，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：95[中国|青岛]
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。