一种无血清细胞冻存液、制备方法及其使用方法技术

本发明专利技术公开了一种无血清细胞冻存液、制备方法及其使用方法，涉及生物医药技术领域。本发明专利技术无血清细胞冻存液包括如下组份：聚乙二醇4～6g/100mL，海藻糖0.5～2.5g/100mL，葡萄糖2～3g/100mL，全反式维甲酸0.5～1.5mg/100mL及少量抗坏血酸0.5mg/100ml，溶剂为无血清基础培养基，最终PH为6.8～7.4；使用方法包括消化、冻存、复苏。本发明专利技术细胞冻存液是成分明确、不含外源血清和有机溶剂，避免外源蛋白污染，同时可不采用程序降温，直接冻存于‑80℃；能有效地保护干细胞活性，维持并保证细胞冻融之后活性不丢失；本发明专利技术冻存方法，复苏时减少细胞吸水涨破的风险，保证细胞活性。

【技术实现步骤摘要】
一种无血清细胞冻存液、制备方法及其使用方法
本专利技术属于生物医药
，特别是涉及一种无血清细胞冻存液、一种无血清细胞冻存液的制备方法以及一种无血清细胞冻存液的使用方法。
技术介绍
随着生物及细胞类制剂的增多，细胞在越来越多方面应用，而细胞的存放往往限制了细胞的应用。在细胞培养过程中随着传代次数的增加，细胞的各种生物特性都会逐渐发生变化。因此原代细胞或细胞种子的及时保存就显得尤为必要。除此之外，购买、交换和运送某些细胞也需要利用细胞冻存的形式来进行。因此，及时方便地进行细胞的冻存在实际工作中显得十分必要。目前，最成熟和最稳定的冻存细胞技术是将加有保护剂的细胞悬液置于-196℃液氮中，这样可以使细胞暂时脱离生长状态而保持细胞的特性，在需要的时候经过复苏程序，使得细胞重新生长增殖以用于实验。关于细胞冻存损伤的现象，研究提出了两因素假说：冰晶损伤假说和溶液损伤假说。两种假说归结于“溶质损伤”和“胞内冰损伤”两大原因，现有冻存液也是基于此来设计冻存液及降温速率。因此，目前细胞冻存及复苏的基本原则普遍遵循的是慢冻快融的方式，实践证明这样可以最大限度的保存细胞活力。但是，无论采用什么方式冻存细胞，都必须加入一种或多种保护剂类物质，以避免细胞以上述两种假说中所描述的方式致使结构受到破坏而死亡。目前，细胞冻存要取得好的效果，多采用血清、甘油或二甲基亚砜(DMSO)等作为保护剂。这些物质有些能提高细胞膜对水的通透性，在缓慢冷冻过程中可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。渗透性保护剂DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤程度。分子量较大或不容易进入细胞内的非渗透性保护剂，一般在细胞外发挥作用，如海藻糖、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白(血清的主要成分)、羟乙基淀粉等。非渗透性保护剂通过稀释降低胞外电解质的浓度，减少溶质损伤，结合水分子，降低胞外自由水的含量，减少冰晶的形成。在这些保护剂中，渗透性保护剂DMSO和非渗透性保护剂的联合使用最为广泛。因为DMSO对细胞存在一定的毒性，在目前仍未发现保护效果用量受到限制，降低或者不使用DMSO，寻找其它替代物是最好的选择。但是目前，该
还未发现冻存保护效果能与DMSO媲美的物质，因此，联合其它成分，形成新的配方，降低DMSO的含量就成了较为现实的选择。血清由于其动物来源的特性，会极大增加带来杂质蛋白、病毒等感染物质的可能，而且，血清来源受限，价格昂贵。因此，寻找替代血清的非渗透性保护剂也显得尤为必要。尽管非渗透性保护剂在细胞冷冻保存过程中都能起到一定的保护作用，但是单独起到保护作用的能力还是有限的，因此，将多种保护剂进行组合，优化出一个合适的配方比例，就显得尤为必要。本专利技术提供了一个新型的冻存液体系，不仅可以除去对血清的使用，免除了阶段性降温的繁琐过程，而且还显著降低了DMSO的用量，从而为无血清低DMSO冻存液提供了更多的选择。
技术实现思路
本专利技术提供了一种无血清细胞冻存液、制备方法及其使用方法，解决了以上问题。为解决上述技术问题，本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术的一种无血清细胞冻存液，包括如下组份：聚乙二醇4～6g/100mL，海藻糖0.5～2.5g/100mL，葡萄糖2～3g/100mL，全反式维甲酸0.5～1.5mg/100mL及少量抗坏血酸0.5mg/100ml，溶剂为无血清基础培养基，最终PH为6.8～7.4。一种无血清细胞冻存液的制备方法，具体配置方法包括如下步骤(以100ml为例)：S01、称取5g上述浓度的聚乙二醇溶解于80ml基础培养基中；S02、加入2g上述浓度的海藻糖，搅拌使其溶解；S03、加入2.5g上述浓度的葡萄糖，搅拌使其溶解；S04、加入1mg上述浓度的全反式维甲酸，搅拌使其溶解；S05、加入0.5mg上述浓度的抗坏血酸，搅拌使其溶解；SS06、将配置好的细胞冻存液通过1mol/L的盐酸或NaOH调节PH至7.2，最后用基础培养基定容至100ml，于2-8℃保存。一种无血清细胞冻存液的使用方法，包括如下步骤：T01、消化：将培养汇合度为75％～85％的细胞取出，清洗；使用胰酶进行消化，离心弃废液，保留沉淀；加入冻存液，重悬得细胞悬液，细胞液浓度约为1×106个/mL；T02、冻存：将上述细胞悬液放入-80℃后，隔天放置于液氮保存；T03、复苏：将冻存的细胞，放置于37±0.5℃下解冻，离心，保留沉淀，加入完全培养基重悬，接种，培养。本专利技术相对于现有技术包括有以下有益效果：1、该专利技术的细胞冻存液是成分明确、不含外源血清和有机溶剂，避免外源蛋白污染，同时可不采用程序降温，直接冻存于-80℃；保护点：该试剂的成分设计即该细胞冻存液的配方，主要成分及其用量以及该试剂的使用方法。2、本专利技术的细胞冻存液，不含外源血清和有机溶剂，避免外源蛋白污染，且不会对细胞产生毒害作用，作为通用型冻存液的基础上，还联合使用了全反式维甲酸和抗坏血酸，能有效地保护干细胞活性，维持并保证细胞冻融之后活性不丢失。3、本专利技术的冻存方法，采用本专利技术的细胞冻存液对细胞进行冻存，冻存细胞密度合理，冻存降温时温度传导均匀，不易产生冰晶，有效减少对细胞的伤害，提高复苏后细胞的活性，而且，由于不含外源血清和有害物质，大大减少了外源性污染的可能性。4、本专利技术的复苏方法，采用了本专利技术的细胞冻存液进行冻存后，复苏时减少细胞吸水涨破的风险，保证细胞活性。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例描述所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为本专利技术一种无血清细胞冻存液的制备方法的步骤图；图2为本专利技术一种无血清细胞冻存液的使用方法的步骤图；图3为本专利技术实施例1以A549细胞的冻存复苏检测的显微镜下照片；图4为本专利技术实施例2以HUVEC细胞的冻存复苏检测的显微镜下照片。具体实施方式下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种无血清细胞冻存液，包括如下组份：聚乙二醇4～6g/100mL，海藻糖0.5～2.5g/100mL，葡萄糖2～3g/100mL，全反式维甲酸0.5～1.5mg/100mL及少量抗坏血酸0.5mg/100ml，溶剂为无血清基础培养基，最终PH为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种无血清细胞冻存液，其特征在于，包括如下组份：/n聚乙二醇4～6g/100mL，海藻糖0.5～2.5g/100mL，葡萄糖2～3g/100mL，全反式维甲酸0.5～1.5mg/100mL及少量抗坏血酸0.5mg/100ml，溶剂为无血清基础培养基，最终PH为6.8～7.4。/n

【技术特征摘要】
1.一种无血清细胞冻存液，其特征在于，包括如下组份：
聚乙二醇4～6g/100mL，海藻糖0.5～2.5g/100mL，葡萄糖2～3g/100mL，全反式维甲酸0.5～1.5mg/100mL及少量抗坏血酸0.5mg/100ml，溶剂为无血清基础培养基，最终PH为6.8～7.4。


2.如权利要求1所述的一种无血清细胞冻存液的制备方法，其特征在于，具体配置方法包括如下步骤(以100ml为例)：
S01、称取5g上述浓度的聚乙二醇溶解于80ml基础培养基中；
S02、加入2g上述浓度的海藻糖，搅拌使其溶解；
S03、加入2.5g上述浓度的葡萄糖，搅拌使其溶解；
S04、加入1mg上述浓度的全反式维甲酸，搅...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴军，黄人卉，于树祥，
申请(专利权)人：上海雅酶生物医药科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31