使用了试样细菌的RNA的细菌鉴定方法及用于其的试剂盒技术

本发明专利技术的目的在于提供能够在不改变用于鉴定的试剂、条件的情况下对并非有限的数种细菌、而是多种细菌进行鉴定的鉴定方法。另外，本发明专利技术的目的在于提供仅通过1次PCR来高灵敏度地进行检测·鉴定、能够减轻繁杂的操作及作业人员的负担的鉴定方法。本发明专利技术中，细菌的鉴定使用具有以下的工序的方法。工序(1)，使用下述第一反应体系进行逆转录反应，得到含有合成的cDNA及逆转录用引物的反应混合物，所述第一反应体系含有：所述逆转录用引物，其用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA；从试样中的细菌中提取的RNA；及具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶；工序(2)，使用下述第二反应体系实施PCR，所述第二反应体系含有：所述反应混合物；引物对，其用于合成包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA；及具有DNA依赖型DNA聚合酶活性的酶，其中，第二反应体系中，由所述反应混合物供给的所述逆转录用引物的浓度为0.08nM以上且20nM以下；及工序(3)，从PCR后的所述第二反应体系中，检测包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA的生成。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用了试样细菌的RNA的细菌鉴定方法及用于其的试剂盒
本专利技术涉及试样中的细菌的迅速的鉴定方法及用于其的试剂盒。
技术介绍
败血症是严重的全身感染症，其确定诊断需要检测·鉴定血液中的病原微生物，近年来，败血症的患者数量伴随癌症治疗、器官移植等医疗的高度化而增加。从院内感染的观点考虑，以耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA：methicillin-resistantStaphylococcusaureus)为代表的多药耐药性菌成为败血症的病原菌的情况也较多，为了选择合适的抗生素以拯救患者生命，尽可能迅速地检测·鉴定血液中的病原微生物在临床上是重要的(专利文献1)。基于这样的背景，作为败血症的迅速的检查方法，对使用了PCR(聚合酶链式反应)的检查系统进行了研究。作为这样的检查方法，下述PCR法是已知的：从微生物中提取DNA，将其作为模板，使用特定的引物对通过PCR等进行基因扩增，然后，对微生物特异性的熔解温度(Tm值)的组合、或各Tm值间的差进行分析，从而迅速地进行病原菌的检测·鉴定(专利文献2)。上述PCR法中，通过将提取的DNA本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.细菌鉴定方法，其特征在于，具有以下的工序(1)～(3)：/n工序(1)，使用下述第一反应体系进行逆转录反应，得到含有合成的cDNA及逆转录用引物的反应混合物，所述第一反应体系含有：所述逆转录用引物，其用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA；从试样中的细菌中提取的RNA；及具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶；/n工序(2)，使用下述第二反应体系实施PCR，所述第二反应体系含有：所述反应混合物；引物对，其用于合成包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA；及具有DNA依赖型DNA聚合酶活性的酶，其中，第二反应体系中，由所述反应混合物供给的所述逆转录用引物的浓...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180326 JP 2018-0586631.细菌鉴定方法，其特征在于，具有以下的工序(1)～(3)：
工序(1)，使用下述第一反应体系进行逆转录反应，得到含有合成的cDNA及逆转录用引物的反应混合物，所述第一反应体系含有：所述逆转录用引物，其用于制备包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的cDNA；从试样中的细菌中提取的RNA；及具有RNA依赖型DNA聚合酶活性的酶；
工序(2)，使用下述第二反应体系实施PCR，所述第二反应体系含有：所述反应混合物；引物对，其用于合成包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA；及具有DNA依赖型DNA聚合酶活性的酶，其中，第二反应体系中，由所述反应混合物供给的所述逆转录用引物的浓度为0.08nM以上且20nM以下；及
工序(3)，从PCR后的所述第二反应体系中，检测包含所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA的生成。


2.如权利要求1所述的细菌鉴定方法，其特征在于，在不同的反应容器内、或者在相同的反应容器内依次实施所述工序(1)及(2)。


3.如权利要求1或2所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列为细菌的16SrDNA所包含的碱基序列，所述RNA包含所述试样中的细菌的16SrRNA。


4.如权利要求3所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述逆转录用引物包含序列号1的碱基序列。


5.如权利要求3或4所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述引物对为选自由以下的(A组)～(C组)组成的组中的至少1对引物对，
(A组)
·引物对1a：包含序列号2的碱基序列的正向引物和包含序列号3的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对2a：包含序列号4的碱基序列的正向引物和包含序列号5的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对3a：包含序列号6的碱基序列的正向引物和包含序列号7的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对4a：包含序列号8的碱基序列的正向引物和包含序列号9的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对5a：包含序列号10的碱基序列的正向引物和包含序列号11的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对6a：包含序列号12的碱基序列的正向引物和包含序列号13的碱基序列的反向引物的组合；
·引物对7a：包含序列号14的碱基序列的正向引物和包含序列号15的碱基序列的反向引物的组合；
(B组)对所述(A组)的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列的一部分在不损害作为引物的功能的范围内添加、缺失或取代1个或2个碱基而得到的引物对；及
(C组)包含与所述(A组)或(B组)的各引物对中的一条或两条引物的碱基序列对应的互补序列的引物对。


6.如权利要求1至5中任一项所述的细菌鉴定方法，其特征在于，所述工序(3)中，测定生成的双链DNA的Tm值，将得到的Tm值与预先测得的包含用于对鉴定对象细菌进行鉴定的碱基序列的双链DNA的Tm值、或者由它们二次得到的数据进行比较，从而鉴定所述试...

【专利技术属性】
技术研发人员：森重敬，天野仰，矢内久阳，远藤绚子，辻健太郎，
申请(专利权)人：三井化学株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP