基于PDC/PDX药敏实验和多组学检测分析的伴随诊断模型及应用制造技术

本发明专利技术提供了一种基于PDX或PDC模型药敏实验和多组学检测分析的伴随诊断模型，构建方法及应用，包括人源肿瘤细胞系模型及动物移植模型的构建，基于人源肿瘤细胞模型及动物模型的药敏实验，人源肿瘤样本的多组学数据获取，以及“药敏表型‑多组学数据”挖掘分析等四个模块。本发明专利技术提供了四个模块的实现思路和关键方法，以及四个模块之间相互关联和匹配的合理设计，形成了模型构建、药敏实验、组学数据获取、数据整合以及数据挖掘分析一整套集成策略，克服了现有伴随诊断方案研发策略在样本规划、数据采集、数据分析等环节的技术手段的局限性，能够更灵活、更广泛地开展伴随诊断方案研发，同时获得标志物相关的机制解释性线索。

Adjoint diagnosis model and its application based on PDC / PDX drug sensitivity test and multi group analysis

【技术实现步骤摘要】
基于PDC/PDX药敏实验和多组学检测分析的伴随诊断模型及应用
本专利技术属于生物医学
，涉及一套伴随诊断方案研发策略，具体集成了细胞和动物模型构建及药物敏感性实验、多组学数据获取和相关的数据整合分析方法。
技术介绍
肿瘤是世界范围内严重的公共卫生问题。据国际肿瘤研究机构公布的数据显示，每年全球约800万人死于肿瘤，成为人类第一死因。实践证明，以往常用的小鼠自发突变肿瘤模型、小鼠化合物诱变肿瘤模型、肿瘤细胞系模型、细胞系移植肿瘤模型等，并不能很好地模拟肿瘤病灶在患者体内的生物学特性，因此造成实验室阶段性能良好的抗肿瘤药物经常不能对临床病人产生显著疗效。也就是说，缺乏具备肿瘤患者良好对应性的临床前肿瘤模型，是转化失败的重要原因。针对这一问题，源于人肿瘤组织的人源肿瘤异种移植模型/细胞系模型(patientderivedxenograftmodel,patientderivedcelllinemodel,缩写为PDX/PDC)给出了迄今为止最优的解决方案，它与临床肿瘤患者呈现出非常好的生物学相关性，可用于预测临床结果。同时，现有基于血清生化免疫检测的标志物，受限于其技术平台和检测目标等原因，无法从肿瘤复杂遗传背景和异质性中找到关键组合，难以用作抗肿瘤药物的伴随诊断方案。针对这一问题，分子标志物提供了一种最为可靠的伴随诊断解决方案，这得益于以测序为代表包括基因组、外显子组、转录组和蛋白组在内的分子组学检测分析技术的快速发展，成为肿瘤精准医疗的重要基石。人源肿瘤细胞模型(patientderivedcellmodel,缩写为PDC)是研究癌变机理及药物筛选的重要手段，主要涉及肿瘤原代细胞培养，即直接从活体肿瘤标本中分离肿瘤细胞后在体外环境中培养，其细胞的生物学特征和遗传性状与临床表型一致性较高，可以保持原肿瘤的异质性，在许多肿瘤学研究(如个体肿瘤药敏实验、个体化的诊疗方案制定)中就显得尤为重要。人源肿瘤移植模型(patientderivedxenograftmodel,缩写为PDX)是指将病人手术中切除的肿瘤接种到免疫缺陷动物上建立的人源肿瘤异体移植模型。近年来将人体肿瘤移植于免疫缺陷小鼠体内，肿瘤细胞形态、染色体含量和同功酶水平与人体肿瘤一样，细胞动力学和生物化学特征也得到较好的保持，故这种小鼠的异种移植人体肿瘤已成为免疫学和肿瘤学研究中较为理想的模型。目前已成功把将肝癌、结肠癌、乳癌、肺癌、卵巢癌、黑色素癌、胃癌、淋巴瘤和白血病、肾病、宫颈癌、软组织肉瘤和骨肉瘤等移植于免疫缺陷小鼠，获得一定比例的良好生长肿瘤部分并可进行传代。人源肿瘤移植模型能模拟人体内环境，为抗肿瘤药物发现提供了一种与临床相近的模型。已有研究表明人源肿瘤移植模型具有与原始病人肿瘤相同的组织学特征并维持了病人肿瘤的异质性，并且人源肿瘤移植模型保留了病人肿瘤基本的基因组和表达谱特点。基于以上特点，人源肿瘤移植模型最主要的应用是作为在体内对抗癌药物敏感性实验的研究工具，进行药物敏感性实验，检测肿瘤药效相关标志物。通过PDX/PDC技术结合多组学检测，本专利技术提供了一种“模型构建-药敏实验-组学数据获取-关联分析”系统研发策略，可以同时收集抗肿瘤药物的药效数据和药效实验中PDX/PDC模型相关的多组学数据，并进行整合挖掘；可以克服肿瘤复杂遗传背景、肿瘤异质性和模型药效对应性等问题，有效加速相应伴随诊断方案的研发。
技术实现思路
本专利技术提出了一套系统整合的伴随诊断研发策略，包括基于PDX或PDC模型药敏实验和多组学检测分析的伴随诊断模型，构建方法及应用，其中包括人源肿瘤细胞系模型(PDC)及人源肿瘤移植动物模型(PDX)的构建，基于PDC和PDX的药物敏感性实验，人源肿瘤样本的多组学数据获取，以及“药敏表型-多组学数据”挖掘分析。本专利技术提供的基于PDX或PDC模型药敏实验和多组学检测分析的伴随诊断模型，具体包括：步骤1)根据伴随诊断方案研发目标，确定药敏实验和多组学数据检测分析模式：P*A*N，其中，P表示肿瘤患者的数量，P为整数，P≥3；A表示实验臂的数量，A为整数，A≥1；N表示携带同一患者肿瘤组织的小鼠分到每个臂的数量，N为整数，N≥1；P<10，记为P0；P≥10，记为P1；其中，所述步骤1)包括以下步骤1.1)～1.3)步骤1.1)若A＝1且P<10，则确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P0*1*N；否则，执行步骤1.2)；步骤1.2)若A＝1且P≥10，则确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P1*1*N；否则，执行步骤1.3)；步骤1.3)若A>1且P<10，则确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P0*A*N；否则，确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P1*A*N；步骤2)根据步骤1)中确定的药敏和多组学数据检测分析模式，进行PDX和/或PDC模型构建和/或复苏，包括以下步骤；步骤2.1)PDX模型构建或复苏，具体步骤如下：步骤2.1.1)肿瘤样本的获取：当进行PDX模型构建时，肿瘤样本为手术过程中采集的新鲜肿瘤组织；当进行PDX模型复苏时，肿瘤样本为冷冻保藏的肿瘤组织；步骤2.1.2)肿瘤样本前处理：将肿瘤组织样本置于适量的含有青霉素400U/mL、链霉素400ug/mL、10％BSA的无菌RPMI1640或者DMEM细胞培养液中，保证取材的无菌性，小心剥离及去除肿瘤包膜、结缔组织、坏死组织、脂肪组织等。步骤2.1.3)将组织切成1～3mm3的小块，放入500-1000μl基质胶(CoringMatrigelMatrix)中预处理1～5分钟待用。步骤2.1.4)肿瘤组织接种可分为皮下接种、肾包膜接种、腹腔大网膜接种等方式，具体接种步骤如下：步骤2.1.4.1)皮下接种：用镊子夹出1块组织块，放入接种针/套管针中，使用套管针将组织块注入免疫缺陷小鼠前肢或后肢与躯干交界处的皮下组织。每只小鼠接种1～2个部位，每个接种位点注入4-5小块组织块。接种应在超净台中进行。步骤2.1.4.2)肾包膜及腹腔大网膜接种：免疫缺陷小鼠进行麻醉，然后打开小鼠腹腔，用手术剪剪开肾包膜或腹腔大网膜，用镊子夹出1块组织块，放入膜下，再缝合肾包膜或者腹腔大网膜。接种应在超净台中进行。步骤2.1.5)肿瘤生长观测：对于皮下接种的PDX模型，在免疫缺陷小鼠接种肿瘤组织后，通过肉眼或者触摸等手段，每周至少观察1次肿瘤的生长情况，当通过肉眼或者触摸等手段，观察到瘤体形成后，定期测量并记录动物体重和瘤体体积；对于肾包膜及腹腔大网膜接种的PDX模型，在免疫缺陷小鼠接种肿瘤组织后通过触摸或小动物活体成像的方式，每周至少观察1次肿瘤的生长情况，当通过触摸或小动物活体成像等手段，观察到瘤体形成后，定期测量并记录动物体重和瘤体体积。步骤2.1.6)肿瘤组织收获：当瘤体的体积达到1000～1500mm3时(荷瘤鼠有多个瘤体的，以最大的瘤体为原则)，可以收获肿瘤组织，用于后续扩大接种。步骤2.1.7本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于PDX或PDC模型药敏实验和多组学检测分析的伴随诊断模型的应用，其特征在于，包括以下步骤：/n步骤1)根据伴随诊断方案研发目标，确定药敏实验和多组学数据检测分析模式：P*A*N；其中，P表示肿瘤患者的数量，P为整数，P≥3；A表示实验臂的数量，A为整数，A≥1；N表示携带同一患者肿瘤组织的受试个体分到每个臂的数量，N为整数，N≥1；P<10，记为P0；P≥10，记为P1；其中，所述步骤1)包括以下步骤1.1)～1.3)/n步骤1.1)若A＝1且P<10，则确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P0*1*N；否则，执行步骤1.2)；/n步骤1.2)若A＝1且P≥10，则确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P1*1*N；/n否则，执行步骤1.3)；/n步骤1.3)若A>1且P<10，则确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P0*A*N；否则，确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P1*A*N；/n步骤2)根据步骤1)中确定的药敏和多组学数据检测分析模式，进行PDX和/或PDC模型构建和/或复苏；/n步骤3)药敏实验数据采集分析，定量化药物效果，对肿瘤患者进行分组；/n步骤4)根据方案设计对分组肿瘤患者进行多组学检测并记录整理其数据；/n步骤5)多组学伴随诊断标志物挖掘模式选择；/n步骤6)形成一种基于PDX或PDC模型药敏实验配套的多组学标志物挖掘方案，并得到肿瘤伴随诊断相关的基因标志物组合。/n...

【技术特征摘要】
1.一种基于PDX或PDC模型药敏实验和多组学检测分析的伴随诊断模型的应用，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1)根据伴随诊断方案研发目标，确定药敏实验和多组学数据检测分析模式：P*A*N；其中，P表示肿瘤患者的数量，P为整数，P≥3；A表示实验臂的数量，A为整数，A≥1；N表示携带同一患者肿瘤组织的受试个体分到每个臂的数量，N为整数，N≥1；P<10，记为P0；P≥10，记为P1；其中，所述步骤1)包括以下步骤1.1)～1.3)
步骤1.1)若A＝1且P<10，则确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P0*1*N；否则，执行步骤1.2)；
步骤1.2)若A＝1且P≥10，则确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P1*1*N；
否则，执行步骤1.3)；
步骤1.3)若A>1且P<10，则确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P0*A*N；否则，确定药敏实验和多组学数据检测分析模式为P1*A*N；
步骤2)根据步骤1)中确定的药敏和多组学数据检测分析模式，进行PDX和/或PDC模型构建和/或复苏；
步骤3)药敏实验数据采集分析，定量化药物效果，对肿瘤患者进行分组；
步骤4)根据方案设计对分组肿瘤患者进行多组学检测并记录整理其数据；
步骤5)多组学伴随诊断标志物挖掘模式选择；
步骤6)形成一种基于PDX或PDC模型药敏实验配套的多组学标志物挖掘方案，并得到肿瘤伴随诊断相关的基因标志物组合。


2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤2)中PDX和/或PDC模型构建和/或复苏后，对模型样本和模型所来源的原始肿瘤患者的组织样本进行一致性评价，包括病理学、免疫组化染色、高通量测序、蛋白组检测之任一或其组合；其中，高通量测序和蛋白组检测一致性评价中，既可基于全谱进行，也可仅评价COSMICCancerGeneCensus中所涉及目标基因或蛋白。


3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤3)具体包括以下子步骤：
步骤3.1)药敏实验数据采集；
步骤3.2)药敏实验数据预处理；
步骤3.3)药物效果的定量化，包括药敏反应级别疾病控制率DCR和抑瘤率TGI；
步骤3.4)根据步骤3.3)定量化的药物效果，按实验臂基于接受药物治疗的效果对肿瘤患者进行排序，根据中位值或分位数，分为药物敏感组Gp和耐药组Gn。


4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，步骤3.4)的具体计算标准是指药物敏感组Gp是由该实验臂处理下，步骤3)中药敏反应级别疾病控制率DCR比例较高或抑瘤率TGI数值较大的肿瘤患者组成，即患者PDX/PDC模型药敏实验的DCR或TGI在该实验臂降序排列中，至少处于前50％，当病例数量P值越大，排名比例可以逐步缩小，至前10％为止；耐药组Gn是由该实验臂处理下，步骤3)中药敏反应级别疾病控制率DCR比例较低或抑瘤率TGI数值较小的肿瘤患者组成，即患者PDX/PDC模型药敏实验的DCR或TGI在该实验臂降序排列中，至少排在后50％，当病例数量P值越大，排名比例可以逐步缩小，至后5％为止。


5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤6)具体包括以下子步骤：
步骤6.1)以转录组和/或蛋白组差异表达为特色的多组学整合挖掘方案；
步骤6.2)以转录组和/或蛋白组差异基因调控为特色的多组学整合挖掘方案；
步骤6.3)肿瘤伴随诊断相关的基因标志物组合优化，基于贪婪算法的逐次增加迭代或基于遗传算法的进化迭代进行。


6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤5)具体包括以下子步骤：
步骤5.1)若模式为P0*1*N，或模式为P1*1*N但其药物敏感组Gp<5或耐药组Gn中肿瘤患者数目<5，则采用步骤6.1)和6.3)挖掘该药物治疗的伴随诊断方案；
步骤5.2)若模式为P1*1*N且其药物敏感组Gp和耐药组Gn中肿瘤患者数目均大于5，则采用步骤6.2)和6.3)挖掘该药物治疗的伴随诊断方案；
步骤5.3)若模式为P0*A*N，则对每一实验臂(药物治疗方法)，分别采用步骤6.1)和6.3)挖掘该药物治疗的伴随诊断方案；
步骤5.4)若模式为P1*A*N，对实验臂分类后进行挖掘，具体分析步骤如下：若实验臂中药物敏感组Gp<5或耐药组Gn中肿瘤患者数目<5，则对该实验臂(药物治疗方法)，则采用步骤6.1)和6.3)挖掘该药物治疗的伴随诊断方案；若实验臂中药物敏感组Gp和耐药组Gn中肿瘤患者数目均大于5，则采用步骤6.2)和6.3)挖掘该药物治疗的伴随诊断方案。


7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤6.1)以转录组和/或蛋白组差异表达为特色的多组学整合挖掘方案，具体包括以下子步骤：
步骤6.1.1)若步骤3)和步骤4)中药物敏感组Gp和耐药组Gn的肿瘤患者仅拥有转录组和/或蛋白组数据，则筛选两组肿瘤患者的组间差异表达基因和/或蛋白，并根据差异倍数和P值进行排序，用于步骤6.3)肿瘤伴随诊断相关的基因标志物组合优化；
步骤6.1.2)若步骤3)和步骤4)中药物敏感组Gp和耐药组Gn的肿瘤患者仅拥有基因组和/或外显子组数据，则对肿瘤患者的体细胞基因变异频率计算、排序，并识别高频变异基因，即基因变异频率≥5％的基因，进而筛选两组肿瘤患者的组间差异的重要变异基因，并根据在样本中的出现比例和频率进行排序，用于步骤6.3)肿瘤伴随诊断相关的基因标志物组合优化；
步骤6.1.3)若步骤3)和步骤4)中药物敏感组Gp和耐药组G...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴文韬，李园园，刘伟，
申请(专利权)人：上海朴岱生物科技合伙企业有限合伙，
类型：发明
国别省市：上海;31