阿胶制品中明胶来源的鉴定方法技术

本发明专利技术公开了一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，包含如下步骤：1.阿胶制品的预处理：阿胶制品水溶液加入牛明胶和猪明胶；固液分离、过滤，滤液冻干；2.样品的酶解：冻干样品经过SDT缓冲液、UA缓冲液、IAA、NH

【技术实现步骤摘要】
阿胶制品中明胶来源的鉴定方法
本专利技术属于鉴定方法
，尤其涉及一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法。
技术介绍
阿胶是采用马科动物驴的鲜皮或干燥皮经去毛漂泡、煎煮、浓缩、并加入各类辅料制成的固体胶类药物，也被称为驴皮胶。其与人参、鹿茸三者一起被称为“中药三宝”，首载于《神农本草经》，并被列为上品。阿胶具有滋阴补血，润燥，止血的功效，其补血功效已被证实。除补血外，阿胶在增强免疫力、抗疲劳、抗辐射、保护大脑、促进骨愈合生长以及保护心血管等方面的功效都已被证实。由于其重要性，阿胶产业现已融入健康中国发展战略。
技术实现思路
本专利技术提供了一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，包含如下步骤：1.阿胶制品的预处理：用去离子水将阿胶制品在50±5℃水浴锅溶解制成的阿胶溶液，向所述阿胶溶液中加入牛明胶和猪明胶，搅拌均匀制成阿胶-牛明胶-猪明胶混合溶液；混合溶液置于离心机中离心，所得上清液进一步过滤，将得到的滤液冻干，备用；2.样品的酶解：将冻干后的样品溶解于SDT缓冲液制成溶液，溶液于沸水中加热，然后离心10～20min，上清液置于超滤离心管中，加入UA缓冲液，置于离心机离心去除上清液，往浓缩物中加入UA缓冲液后再次离心10～20min去除上清液；然后加入IAA的乙醇溶液，于暗室放置20～40min后再次离心10～20min去除上清液；然后加入UA缓冲液，离心10～20min去除上清液，重复此加料、离心操作2次；再加入NH4HCO3水溶液并10～20min离心去除上清液，重复加料、离心操作2次；最后，在浓缩物中加入含胰蛋白酶的NH4HCO3水溶液，37±2℃放置过夜后离心，收集上清液即得到明胶多肽溶液；3.高效液相色谱-质谱检测：明胶多肽溶液上样于EasynLC-OrbitrapFusionTribrid质谱仪检测，采用的柱子为C18柱，流动相A为含有甲酸体积分数0.1%甲酸的水溶液；流动相B为84%的乙腈和16%的水混合溶剂中含有体积分数0.1%的甲酸，在250nl/min的流速下洗脱60min，由流动相A线性梯度变化为流动相B，采用数据依赖采集模式动态收集丰度最高的10个母离子进行HCD裂解，动态排除时间为20s，归一化碰撞能量为27eV；4.数据分析：采用MASCOT软件匹配分析所获得的质谱图，数据库设置为目标胶原蛋白数据库，检索参数包括：半胱氨酸经碘乙酰胺为固定修饰；氧化为可能性修饰；最大的未酶切位点为2；一级质谱错误率为±20ppm；二级质谱错误率为±0.1Da；当Mascot分数大于40时，多肽峰被认定为阳性鉴定或准确度极高（P＜0.05）；依据三种胶原蛋白理论特征性多肽数据库进行阿胶、牛明胶和猪明胶特征性多肽的比对分析，确定阿胶制品中明胶来源。进一步地，所述阿胶制品包括阿胶块、阿胶口服液、阿胶颗粒、阿胶糕。进一步地，所述阿胶溶液为阿胶制品和去离子水按料水比80～120mg/mL的比例混合溶解而成；按配置阿胶溶液所用的阿胶制品质量1%的量向阿胶溶液中分别加入牛明胶和猪明胶，牛明胶和猪明胶的质量均为阿胶制品质量的1%。进一步地，所述步骤1中，上清液经过0.45μm的过滤器过滤获得滤液。进一步地，所述步骤2中，SDT缓冲液中SDS的质量百分含量为4%～5%，二硫苏糖醇的浓度为100～110mM、pH8Tris-HCl的浓度为150～160mM，其余为水；冻干后的样品溶解于所述SDT缓冲液制成冻干后的样品浓度为1μg/μL的溶液；沸水中加热时间为2～5min；所述超滤离心管的截留分子量为10kDa；所述UA缓冲液中尿素的浓度为6～10M，pH8.0Tris-HCl的浓度为150mM，其余为水；所述IAA的乙醇溶液中IAA的浓度为50～60mM；所述NH4HCO3水溶液中NH4HCO3浓度为25mM；所述含胰蛋白酶的NH4HCO3水溶液中胰蛋白酶的浓度为2μg/40μL，NH4HCO3浓度为25mM。进一步地，所述10个母离子的m/z范围为300-1800。进一步地，所述目标胶原蛋白为驴皮、牛皮和猪皮胶原蛋白。因此，通过上述技术方案可知，本专利技术的有益效果在于：本专利技术所述方法能够快速准确的鉴定阿胶制品中明胶来源，操作简单，成本低廉，鉴定精度高，误差较小。具体实施方式下面结合实施例进行详细的说明：一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，包含如下步骤：1.阿胶制品的预处理用去离子水将阿胶制品（可以是阿胶块、阿胶口服液、阿胶颗粒、阿胶糕等中的任意一种）在50℃水浴锅溶解制成阿胶制品浓度100mg/ml的阿胶溶液，按照阿胶制品1%（w/w）的比例分别向阿胶溶液中加入牛明胶和猪明胶，牛明胶和猪明胶的质量均为阿胶制品质量的1%，搅拌均匀制成阿胶-牛明胶-猪明胶混合溶液。置于离心机中以6000g的速度离心25min，所得上清液进一步通过0.45μm的过滤器处理，将得到的滤液冻干，备用。2.样品的酶解将冻干后的样品溶解于SDT缓冲液（质量百分含量4%SDS、100mM二硫苏糖醇、150mMpH8.0Tris-HCl，其余为水）制成冻干后的样品浓度为1μg/μL的溶液，于沸水中加热3min，然后在离心机中12000g离心15min。将上清液置于超滤离心管（截留分子量为10kDa）中，加入200μLUA缓冲液（8M尿素，150mMpH8.0Tris-HCl，其余为水），置于离心机中14000g，离心15分钟去除上清液。再往浓缩物中加入200μL所述UA缓冲液后再次离心去除上清液。然后，加入100μL50mM的IAA乙醇溶液，于暗室放置30min后离心15min去除上清液。然后，加入100μL所述UA缓冲液，以14000g的速度离心15分钟去除上清液，再重复此加料、离心操作2次。再加入100μL的25mMNH4HCO3水溶液并离心去除上清液，重复此加料、离心操作2次。最后，在浓缩物中加入含2μg胰蛋白酶的40μL25mMNH4HCO3水溶液，37℃放置12h后离心20min收集滤液即得到明胶多肽溶液。3.高效液相色谱-质谱检测混合明胶酶解液上样于EasynLC-OrbitrapFusionTribrid质谱仪检测，采用的柱子为C18柱（75μm×150mm）。流动相A为含有甲酸体积分数0.1%甲酸的水溶液；流动相B为84%的乙腈和16%的水混合溶剂中含有体积分数0.1%的甲酸。在250nl/min的流速下洗脱60min，由流动相A线性梯度变化为流动相B。采用数据依赖采集模式动态收集丰度最高的10个母离子（m/z范围为300-1800）进行HCD裂解。动态排除时间为20s，归一化碰撞能量为27eV。4.数据分析采用MASCOT软件匹配分析所获得的质谱图，数据库设置为目标胶原蛋白（驴皮、牛皮和猪皮胶原蛋白）数据库。检索参数包括：半胱氨酸经碘乙酰胺为固定修饰；氧化为可能性修饰；最大的未酶切位点为2；一级质谱错误率为±20ppm；二级质谱错误率为±0.1Da；当Mascot分数大于40时，多肽峰被认定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，其特征在于，包含如下步骤：/n阿胶制品的预处理：用去离子水将阿胶制品在50±5℃水浴锅溶解制成的阿胶溶液，向所述阿胶溶液中加入牛明胶和猪明胶，搅拌均匀制成阿胶-牛明胶-猪明胶混合溶液；混合溶液置于离心机中离心，所得上清液进一步过滤，将得到的滤液冻干，备用；/n样品的酶解：将冻干后的样品溶解于SDT缓冲液制成溶液，溶液于沸水中加热，然后离心10～20min，上清液置于超滤离心管中，加入UA缓冲液，置于离心机离心去除上清液，往浓缩物中加入UA缓冲液后再次离心10～20min去除上清液；然后加入IAA的乙醇溶液，于暗室放置20～40min后再次离心10～20min去除上清液；然后加入UA缓冲液，离心10～20min去除上清液，重复此加料、离心操作2次；再加入NH

【技术特征摘要】
1.一种阿胶制品中明胶来源的鉴定方法，其特征在于，包含如下步骤：
阿胶制品的预处理：用去离子水将阿胶制品在50±5℃水浴锅溶解制成的阿胶溶液，向所述阿胶溶液中加入牛明胶和猪明胶，搅拌均匀制成阿胶-牛明胶-猪明胶混合溶液；混合溶液置于离心机中离心，所得上清液进一步过滤，将得到的滤液冻干，备用；
样品的酶解：将冻干后的样品溶解于SDT缓冲液制成溶液，溶液于沸水中加热，然后离心10～20min，上清液置于超滤离心管中，加入UA缓冲液，置于离心机离心去除上清液，往浓缩物中加入UA缓冲液后再次离心10～20min去除上清液；然后加入IAA的乙醇溶液，于暗室放置20～40min后再次离心10～20min去除上清液；然后加入UA缓冲液，离心10～20min去除上清液，重复此加料、离心操作2次；再加入NH4HCO3水溶液并10～20min离心去除上清液，重复加料、离心操作2次；最后，在浓缩物中加入含胰蛋白酶的NH4HCO3水溶液，37±2℃放置过夜后离心，收集上清液即得到明胶多肽溶液；
高效液相色谱-质谱检测：明胶多肽溶液上样于EasynLC-OrbitrapFusionTribrid质谱仪检测，采用的柱子为C18柱，流动相A为含有甲酸体积分数0.1%甲酸的水溶液；流动相B为84%的乙腈和16%的水混合溶剂中含有体积分数0.1%的甲酸，在250nl/min的流速下洗脱60min，由流动相A线性梯度变化为流动相B，采用数据依赖采集模式动态收集丰度最高的10个母离子进行HCD裂解，动态排除时间为20s，归一化碰撞能量为27eV；
数据分析：采用MASCOT软件匹配分析所获得的质谱图，数据库设置为目标胶原蛋白数据库，检索参数包括：半胱氨酸经碘乙酰胺为固定修饰；氧化为可能性修饰；最大的未酶切位点为2；一级质谱错误率为±20ppm；二级质谱错误率为±0.1Da；当Mascot分数大于40时，多肽峰被认定为阳性鉴定或准确度极高（P＜0.05）...

【专利技术属性】
技术研发人员：沙小梅，涂宗财，蒋文丽，张路正，王光耀，胡姿姿，张丽君，
申请(专利权)人：江西师范大学，
类型：发明
国别省市：江西;36