【技术实现步骤摘要】
海洋源产PHA菌富集培养及接种、PCR扩增基因方法
本专利技术涉及细菌富集培养、PCR扩增基因的
，特别涉及一种海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集培养基配置方法、接种方法、利用聚合酶链式反应(PCR)扩增16SrRNA基因序列的方法及扩增phaC合成酶基因的方法。
技术介绍
聚羟基脂肪酸酯(PHA)是由细菌合成的一类3-羟基脂肪酸组成的线型聚酯。这种材料具有良好的生物相容性、生物可降解性和塑料的热加工性能，是目前生物医用材料领域和生物可降解包装材料领域的热点材料。菌株的phaC合成酶的底物特异性和合成效率直接影响构成PHA的单体种类、单体排布方式和PHA分子量大小，从而获得不同生物降解性、热塑性、延展性和通气性等理化性质的材料。这些材料可用于生产膜、袋和瓶以及心脏瓣膜等。目前，推测PHA的结构超过150种，但是，实现大规模商业化生产的PHA种类只有4大类。因此，从环境中获得新型phaC合成酶，对开发新型PHA有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是解决产PHA细菌分离效率低的问题，提出从海...
【技术保护点】
1.一种海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集培养基的配置方法，其特征在于，富集培养基使用盐度和含油量梯度增加的基本培养基(minimal medium，MM培养基)，培养基的配置方法，包括以下步骤：/n⑴富集培养基以MM培养基为基础添加油和盐，将1mL微量元素，溶解于1L的0.1mol/LHCl中；/n⑵富集培养基中按照设定比例添加油类和氯化钠(NaCl),所述MM培养基的含油量从1％开始，每个培养周期后提高0.5～1％含油量，含盐量从陈海水盐度从35‰开始，每个培养周期后，通过添加氯化钠(NaCl)，盐度提高为10‰；每个培养周期使用的梯度提高比例的MM培养基，以所在周期命名；...
【技术特征摘要】
1.一种海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集培养基的配置方法，其特征在于，富集培养基使用盐度和含油量梯度增加的基本培养基(minimalmedium，MM培养基)，培养基的配置方法，包括以下步骤：
⑴富集培养基以MM培养基为基础添加油和盐，将1mL微量元素，溶解于1L的0.1mol/LHCl中；
⑵富集培养基中按照设定比例添加油类和氯化钠(NaCl),所述MM培养基的含油量从1％开始，每个培养周期后提高0.5～1％含油量，含盐量从陈海水盐度从35‰开始，每个培养周期后，通过添加氯化钠(NaCl)，盐度提高为10‰；每个培养周期使用的梯度提高比例的MM培养基，以所在周期命名；
⑶调节培养基的pH值到7.4，在121℃下，高压灭菌20min。
2.根据权利要求1所述海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集培养基的配置方法，其特征在于，步骤⑴所述MM培养基由以下质量分数wt％组成：
3.一种海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集的接种方法，其特征在于，包括以下步骤：
⑴以1:100的比例将海洋沉积物与MM1培养基混合，在摇床中充分摇晃培养一个周期，培养后的沉积物和培养基混合物称为富集培养液；将当前MM1培养基中的富集培养液，以1:100的比例接种至下一个梯度的MM2培养基中，以此类推，完成6～8个周期的富集培养，所述一个周期为7～10天；
⑵每富集完成2～3个周期后，进行一次分离，得到形态、颜色均一的单菌落；
⑶通过菌落PCR扩增所述纯化的单菌落的phaC合成酶基因，然后利用琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，根据凝胶上是否有明显的条带判断菌株是否产PHA，并利用PCR扩增16SrRNA基因，一代测序来鉴定菌株的分类地位。
4.根据权利要求3所述海洋源产聚羟基脂肪酸酯细菌富集的接种方法，其特征在于，步骤⑵所述的分离步骤进一步包括：
(2.1)快速摇动富集培养液30s使沉积物悬浮，然后取30μL悬浮液进行梯度稀释，每个稀释度涂布至2216E培养基表面，在30℃下培养2～7天；
(2.2)每天根据菌落的形态特征，利用三区划线的方法纯化菌落，直到得到颜色形态均一的单菌落。...
【专利技术属性】
技术研发人员：郑维爽，黄艺，于盛洋，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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