【技术实现步骤摘要】
一种牛源抗金黄色葡萄球菌的单链抗体及其制备和应用
本专利技术涉及牛源抗体药物领域，尤其涉及一种牛源抗金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)的单链抗体及其制备和应用。
技术介绍
单链抗体是一种基因工程抗体，通过DNA重组技术将抗体轻链可变区VL和重链可变区VH通过一段连接短肽linker首尾连接而成，是保留完整抗原结合部位的最小功能片段。单链抗体的表达形式主要有融合表达，胞内表达和分泌表达三种形式。和完整抗体相比，单链抗体具有以下优点：1)分子量小，大小仅为完整抗体的六分之一，免疫原性较低；2)组织穿透力强，容易进入实体瘤周围的微循环；3)血液清除快，肾脏蓄积很少；4)无Fc段，非特异结合低；5)易于通过基因工程大量生产；6)易于基因操作，更易构建重组免疫毒素。奶牛乳腺炎是影响奶牛业发展，给乳品生产造成巨大损失的一种常见多发病。引起奶牛乳腺炎的致病菌很多，其中金黄色葡萄球菌是最重要的致病菌之一，发病率达到了50％以上，导致严重的经济损失。因为金黄色葡萄球菌具有传染性，且治疗用的抗生素易产生耐药性，所以很难彻底治愈。目前针对金黄色...
【技术保护点】
1.一种牛源抗金黄色葡萄球菌的单链抗体，其特征在于，至少包括牛抗体轻链可变区(VL)、牛抗体重链可变区(VH)和中间连接肽(Linker)，其中，所述牛抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述牛抗体重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQ IDNo.2；所述中间连接肽(Linker)的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述单链抗体连接顺序是VL-Linker-VH，具有如SEQ ID No.4所示的氨基酸序列。/n
【技术特征摘要】
1.一种牛源抗金黄色葡萄球菌的单链抗体，其特征在于，至少包括牛抗体轻链可变区(VL)、牛抗体重链可变区(VH)和中间连接肽(Linker)，其中，所述牛抗体轻链可变区(VL)的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示，所述牛抗体重链可变区(VH)的氨基酸序列如SEQIDNo.2；所述中间连接肽(Linker)的氨基酸序列如SEQIDNo.3所示；所述单链抗体连接顺序是VL-Linker-VH，具有如SEQIDNo.4所示的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的一种牛源抗金黄色葡萄球菌的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的编码基因为牛源性单链抗体基因，所述牛源性单链抗体基因含有酶切位点SfiI和酶切位点NotI，其中，所述酶切位点SfiI的核苷酸序列如SEQIDNo.5所示，所述酶切位点NotI的核苷酸序列如SEQIDNo.6所示。
3.如权利要求2所述的一种牛源抗金黄色葡萄球菌的单链抗体，其特征在于，所述牛源性单链抗体基因含有酶切位点BamHI和酶切位点XhoI，其中，所述酶切位点BamHI的核苷酸序列为GGATCC，所述酶切位点XhoI的核苷酸序列为CTCGAG。
4.如权利要求1所述的一种牛源抗金黄色葡萄球菌的单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的纯化蛋白的分子量为50～54kDa。
5.如权利要求1-4任一项所述的一种牛源抗金黄色葡萄球菌的单链抗体的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)采用RT-PCR直接从奶牛的外周血单个核细胞RNA中扩增出牛抗体编码基因的重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL)；所述奶牛患乳腺炎；
(2)利用SOE-PCR法将linker与步骤(1)得到的VH基因和VL基因相连，构建牛源性单链抗体基因，所述牛源性单链抗体基因的重组连接顺序是VL-linker-VH；
(3)将步骤(2)得到的牛源性单链抗体基因克隆到噬菌粒载体pCANTAB5E中，构建重组质粒(VL-linker-VH)；
(4)将步骤(3)得到的重组质粒(VL-linker-VH)转化入大肠杆菌，培养并用辅助噬菌体扩增建立初级单链抗体文库；
(5)用金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素LukED的S组分(LukE)作为包被抗原，将步骤(3)得到的初级单链抗体文库富集淘选3～5轮，得到克隆；
(6)采用phageELISA,用金黄色葡萄球菌双组分杀白细胞素LukED的S组分(LukE)作为包被抗原，从步骤(5)得到的所述克隆里筛选阳性克隆；
(7)将步骤(6)筛选得到的阳性克隆酶切，回收单链抗体编码基因scFv，与同步酶切的原核表达载体pGE...
【专利技术属性】
技术研发人员：朱建国，张蕾，王凤青，闫洁新，程曼玲，张凡庆，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：上海;31
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