万寿菊根茎活性成分及其在防治青枯菌中的应用制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及万寿菊根茎活性成分及其在防治青枯菌中的应用。本发明专利技术研究了各种提取方法提取的万寿菊根茎中的活性物质对青枯菌的作用，确定万寿菊根茎中柠檬烯，α‑三联噻吩为具有抑制青枯病的活性物质，并提供了相应的制备方法。进一步验证在烟草盆栽试验中柠檬烯、α‑三联噻吩对青枯菌HF‑1‑1的防效，发现在烟苗生长的第9周，α‑三联噻吩对HF‑1‑1的抑制效果为28.63％，而柠檬烯对HF‑1‑1的防效达到62.27％。由此奠定了植物源杀菌物质——万寿菊根茎提取物柠檬烯对烟草土传病害的防治基础。

Active components of marigold rhizome and their application in controlling Ralstonia solanacearum

【技术实现步骤摘要】
万寿菊根茎活性成分及其在防治青枯菌中的应用
本专利技术属于生物
，尤其涉及万寿菊根茎活性成分及其在防治青枯菌中的应用。
技术介绍
烟草是我国主要的经济作物之一，由于烟田多年连作，化肥和农药大量施用，导致烟草病虫害，特别是土传病害严重，严重制约着烟草行业的健康发展。传统化学药剂的施用对烟草土传病害防效不佳，易发生抗药性，且容易造成药物残留等环境污染问题。黑胫病(Tobaccoblackshank)和青枯病(Tobaccobacterialwilt)是烟草团棵、旺长期常见病害，其表现为烟株凋萎、叶片黄化、茎秆发黑。烟草青枯病常与烟草黑胫病、根结线虫病混合发生，严重时可导致全田烟草枯死，给烟农造成巨大的经济损失。开发并推广应用烟草土传病害生防菌剂，避免或减少化学药剂的施用，对降低烟草土传病害发生，保障烟农种植产量产值和烟农种植的积极性，以及降低环境污染，具有现实生产意义。植物源农药因具有无残留、低毒、不易产生抗药性，且易与其他药剂混配等优点，已成为近年来国内外研究的热点之一。许多研究发现，万寿菊对多种病原微生物具有较好的抑制或毒杀作用。万寿菊在烟草土传病害防治，特别是青枯病，黑胫病等方面具有广泛的应用前景，深入研究万寿菊抗病机制尤为重要。已有研究主要集中在其不同部位粗提物对病原菌菌丝生长和孢子萌发的影响上，以及对粗提物处理的感病植株不同生长期与对照样品的一些生理生化指标差异性的测定上。而对于活性成分在植物体内的分布、具体理化性质、结构与活性的关系以及杀菌、抑菌作用机理等的研究基本上属于空白。并且万寿菊作为大面积种植的植物资源，采集部分大多为花部位，而占全株比重较大部分的非花部分一直没有得到较好的利用。前人研究发现万寿菊的花对烟草根结线虫病具有较好的生物活性。实际生活中，万寿菊花一般用于提取叶黄素，且已得到了较好的应用。而叶茎根一般都会被同秸秆等一起焚烧，不仅污染环境，也造成了资源的极大浪费，因此在烟田烟草青枯病的生物防治中，充分研究利用万寿菊叶茎根的杀菌活性，阐明万寿菊提取物成份及成份中哪些物质具有抗菌效果，其结构组成是什么，如何能让其得到最大程度的利用等问题急需解决。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了万寿菊根茎活性成分及其在防治青枯菌中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。本专利技术是这样实现的，一种青枯菌抑菌液的制备方法，包括将万寿菊根茎洗净烘干，磨成粉末，使用石油醚或乙酸乙酯对粉末进行萃取，所述粉末与石油醚或乙酸乙酯的质量体积比为1:20，萃取时间为5h。本专利技术还提供了一种青枯菌抑菌物的制备方法，包括将万寿菊根茎水提物过0.22μm滤膜，进行HPLC法分离，配制乙腈+0.1％三氟乙酸(TFA)和水+0.1％三氟乙酸(TFA)作为流动相；色谱柱C18短柱；流速0.7ml/min；柱温25℃；紫外检测波长330nm；洗脱程序为：收集39-46min的物质，得到青枯菌抑菌物。进一步地，所述青枯菌抑菌物包括柠檬烯、α-三联噻吩中的至少一种。进一步地，所述万寿菊根茎水提物的制备方法为，将万寿菊根茎粉末，放入蒸馏水中，30℃，230rpm摇床振荡2h后，放入超声波中振荡1h，随后放入50℃恒温水浴锅内水浴2h，最后放置过夜；滤膜过滤浸泡液，将过滤后的溶液放入低温浓缩仪中，得万寿菊根茎水提物。本专利技术还提供了柠檬烯在制备防治青枯菌的试剂中的应用。本专利技术还提供了α-三联噻吩在制备防治青枯菌的试剂中的应用。本专利技术还提供了柠檬烯在制备烟草种子萌发促进剂或抑制剂中的应用。本专利技术还提供了α-三联噻吩在制备烟草种子萌发抑制剂中的应用。综上所述，本专利技术的优点及积极效果为：植物是生物活性化合物的天然宝库，其根、茎、叶和花中含有多种抑菌、杀菌的活性成分。目前已有从植物中提取抗真菌、细菌、病毒和线虫的有效成分，以及以分离纯化的单体物质为先导化合物加工而成的新型生物药剂。植物源抗菌剂因其来源于自然，具有易降解、低残留、与环境相容等特点，符合经济生态可持续发展的要求。因此，以植物为作用靶标，从中探寻新的活性先导化合物成为防治经济作物微生物疾病的重要途径，具有良好的发展契机和巨大的市场空间。万寿菊中存在多种抗菌、杀菌活性物质。已被报导的有光活化杀虫物质α-三联噻吩和根提取物中的对西瓜枯萎病菌的抑菌物质等。本研究是提取万寿菊根茎的活性物质来抑制烟草的土传病害青枯病和黑胫病，旨在提高烟草产量，更好地研制植物抗菌剂。具有深远的意义。本专利技术研究了各种提取方法提取的万寿菊根茎中的活性物质对青枯菌的作用，确定万寿菊根茎中柠檬烯和α-三联噻吩为具有抑制青枯病的活性物质，并提供了相应的制备方法。由此奠定了植物源杀菌物质——万寿菊根茎提取物对烟草土传病害的防治基础。附图说明图1是有机溶剂萃取万寿菊根茎后对HF-1-1的抑制作用；图2是万寿菊根茎叶GC-MS的离子峰图；图3是万寿菊根茎的乙醇和水提物对HF-1-1的平板抑菌实验；图4是万寿菊根茎水提取物TLC板分离结果；图5是经柱层析分离后TLC跑板验证；图6是万寿菊根茎水提物的HPLC分离的离子峰图；图7是万寿菊水提物HPLC分离产物对HF-1-1的抑制作用；图8是万寿菊根茎水提物的HPLC分离的离子峰图；图9是物质1的红外谱图；图10是物质1的红外匹配图；图11是物质1的核磁氢谱图；图12是物质1的核磁碳谱图；图13是物质1的气相质谱总离子流图；图14是6.737min处峰的谱库匹配图；图15是物质1的元素分析结果；图16是扫描电镜图；图17是物质2的红外谱图；图18是物质2的红外匹配图；图19是物质2的核磁氢谱图；图20是物质2的核磁碳谱图；图21是物质2的气相质谱总离子流图；图22是18.201min处峰的谱库匹配图；图23是物质2的元素分析结果：图24是扫描电镜图；图25是柠檬烯对HF-1-1的平板抑菌实验；图26是α-三联噻吩和柠檬烯对HF-1-1的平板抑菌实验；图27是验证柠檬烯和α-三联噻吩对HF-1-1的抑菌作用；图28是不同柠檬烯用量对HF-1-1的抑制作用；图29是柠檬烯对HF-1-1生长的影响；图30是α-三联噻吩对HF-1-1生长的影响；图31是不同活性物质处理后烟草青枯病发病率和病情指数统计；di为发病率，DI为病情指数。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术披露万寿菊根茎活性成分及其在防治青枯菌中的应用。本专利技术中使用的万寿菊为温室内种植的4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种青枯菌抑菌液的制备方法，其特征在于：包括将万寿菊根茎洗净烘干，磨成粉末，使用石油醚或乙酸乙酯对粉末进行萃取，所述粉末与石油醚或乙酸乙酯的质量体积比为1:20，萃取时间为5h。/n

【技术特征摘要】
1.一种青枯菌抑菌液的制备方法，其特征在于：包括将万寿菊根茎洗净烘干，磨成粉末，使用石油醚或乙酸乙酯对粉末进行萃取，所述粉末与石油醚或乙酸乙酯的质量体积比为1:20，萃取时间为5h。


2.一种青枯菌抑菌物的制备方法，其特征在于：包括将万寿菊根茎水提物过0.22μm滤膜，进行HPLC法分离，配制乙腈+0.1％三氟乙酸(TFA)和水+0.1％三氟乙酸(TFA)作为流动相；色谱柱C18短柱；流速0.7ml/min；柱温25℃；紫外检测波长330nm；洗脱程序为：



收集39-46min的物质，得到青枯菌抑菌物。


3.根据权利要求2所述的一种青枯菌抑菌物的制备方法，其特征在于：所述青枯菌抑...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨勇，黎妍妍，陈守文，李锡宏，杨小琼，李春黎，马昕，蔡冬波，王勤，
申请(专利权)人：湖北大学，湖北省烟草科学研究院，
类型：发明
国别省市：湖北;42