一种基于NIR光谱定量测定灵芝子实体中总三萜的方法技术

本发明专利技术公开一种基于NIR光谱定量测定灵芝子实体中总三萜的方法，涉及三萜定量检测技术领域，本发明专利技术包括以下步骤：(1)制备灵芝子实体醇提物；(2)采集灵芝醇提物的NIR光谱，波数范围为12000～4000cm

【技术实现步骤摘要】
一种基于NIR光谱定量测定灵芝子实体中总三萜的方法
本专利技术涉及三萜定量检测
，具体涉及一种基于NIR光谱定量测定灵芝子实体中总三萜的方法。
技术介绍
灵芝(Ganodermalucidum)作为一种传统中药，具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、免疫调节、治疗糖尿病、保肝等药理作用。三萜是灵芝主要的生物活性成分之一，能通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞，对肿瘤细胞具有细胞毒性。体外研究表明，灵芝三萜提取物可以抑制人肝癌Huh-7细胞的生长，而对正常的人类肝细胞几乎没有影响。目前已从灵芝中提取了300多种三萜类化合物。从灵芝属植物中分离得到的三萜类化合物结构复杂，这些化合物包括四环(羊毛烷碳骨架)和五环三萜。目前对灵芝三萜的定量检测主要包括比色法和高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography，HPLC)。分光光度法具有简单、快速的优点，能够短时间内大量检测实验样品。如公开号为CN1546992A的专利公开一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法，用紫外分光光度法对灵芝三萜类化合物进行快速、定量的测定。但三萜定量常用的香草醛-冰醋酸-高氯酸显色法无特异性，检测结果易受干扰，且以齐墩果酸作为标准品，灵芝酸的检测值远低于真实值。而HPLC法需要多种三萜标准品，难以定量总萜含量，且对仪器设备条件要求高。因此，灵芝总萜的准确快速定量仍是一个待解决的问题。近红外光谱(Nearinfraredspectroscopy，NIR)位于红外和可见光之间，波长范围为780～2526nm。物质的近红外吸收来源于含氢基团(O-H、N-H、C-H、S-H等)的倍频和组合频。近红外光谱难以直接解释。由于倍频的显著重叠和大量的组合频带，且强度低于中红外，光谱信息本质上是复杂的。因此，近红外光谱是一种间接的分析技术，需要通过参考方法确定已知样品的组成或性质，然后应用最优化学计量方法建立校准模型，对未知样品进行定性和定量分析。目前近红外光谱技术与化学计量学相结合已被广泛应用于天然产物、食品、药品等方面的的定性和定量分析，因为它可以对多种成分进行简单、快速、低成本、无损、同时分析或表征。例如，近红外光谱可用于中草药的鉴别及其化学组分如多糖、三萜、氨基酸、生物碱和脂肪酸等物质的定性和定量研究。但是目前对于灵芝三萜近红外定量分析仍有困难，一方面是因为三萜种类繁多，对于三萜总量本身就缺少定量分析方法，另一方面是灵芝种类繁多，成分复杂，如何应用近红外光谱简化对灵芝子实体三萜定量分析目前也没有一致的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于现有技术中灵芝三萜种类较多，缺少一种对灵芝子实体总三萜准确定量测定的方法。本专利技术通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：一种基于NIR光谱定量测定灵芝子实体中总三萜的方法，包括以下步骤：(1)制备灵芝子实体醇提物：热水浸提灵芝子实体后，收集沉淀，将沉淀冷冻干燥后加入无水乙醇，超声萃取，离心，收集滤液，滤液经减压浓缩后，加入水悬浮浓缩液，石油醚萃取脱脂后蒸干，加入无水乙醇溶解粗提物，经纯化和冷冻干燥后制得灵芝子实体醇提物干粉；(2)采集灵芝醇提物的NIR光谱，波数范围为12000～4000cm-1，收集光谱数据，对光谱数据进行预处理；(3)将灵芝子实体醇提物分为校正集和验证集，校正集样品制备方法是在三萜含量最低的灵芝醇提物中添加不同含量的灵芝酸A标准品，利用校正集确定的灵芝酸A含量和测量光谱构建定量模型，选择波数范围为6102～5446.3cm-1和4605.4～4242.8cm-1，建立基于偏最小二乘的三萜分析模型；(4)将验证集的测量的光谱导入上述三萜分析模型，对照利用高效液相色谱法测定验证集的结果，利用所构建的模型进行结果预测。其中三萜含量最低的灵芝醇提物(三萜含量几乎为零)从测试大量不同样品中选取，利用已知灵芝酸A含量的校正集样品和其NIR测量光谱构建定量模型，基于两方面考虑：一是根据实验中得出的结论，即通过对灵芝子实体醇提物样品进行一定的处理，使得不同的灵芝子实体醇提物样品中含有不同含量的三萜类成分，对这些样品进行NIR光谱采集，测量和分析其NIR光谱图，从中可以找到与灵芝三萜组分密切相关的光谱谱段，使得所选谱段既包含灵芝三萜区域又能减少其它成分的影响；二是校正集构建的定量模型本身，添加灵芝酸A是由于其普遍存在于灵芝中，且含量较高，通过添加灵芝酸A优化对光谱谱段的选择，使得PLS定量计算中R2值和RPD值尽可能大，RMSECV尽可能小，以使该定量模型更准确。并结合三萜标准品的近红外光谱确定特征峰位以提高模型定量的准确性和可靠性。在此基础上，选择波数范围为6102～5446.3cm-1和4605.4～4242.8cm-1，建立基于偏最小二乘的三萜分析模型。有益效果：灵芝子实体易受栽培环境影响，其化学结构也表现出显著的差异，从而导致灵芝产品的有效性差异。灵芝属三萜类物质种类多，结构复杂。本专利技术可以对不同灵芝子实体的总三萜进行NIR测量，获得具有明显三萜特征的醇提物的近红外光谱，得到基于灵芝子实体醇提物构建的灵芝三萜定量模型，预测灵芝子实体总三萜的含量，测定方法简单，解决了灵芝子实体三萜定量难的问题，对灵芝品种选育和灵芝三萜的工业生产有重要意义。优选地，所述灵芝子实体醇提物的制备方法包括以下步骤：将灵芝子实体切片粉碎，并过100目筛，称取灵芝子实体粉末，加ddH2O，料液比为1：40，于80℃水浴3h，离心去除上清，ddH2O洗涤沉淀，收集沉淀，冷冻干燥后获得灵芝子实体粉末，加无水乙醇，料液比1：50，采用超声辅助萃取法，超声萃取90min，静置过夜后，离心，滤液减压浓缩，加水悬浮浓缩液，石油醚萃取脱脂后蒸干，加入无水乙醇溶解粗提物，过0.22μm微孔有机相滤膜，滤液加入4倍体积ddH2O混悬，冷冻干燥机干燥后研磨粉碎，即制得灵芝子实体醇提物。有益效果：灵芝三萜不溶于水，通过醇提去除不溶于水的杂质，使灵芝三萜的浓度增加，然后采用近红外测定排除许多干扰，提高测定结果的准确性。优选地，采集样品的近红外漫反射光谱，波数范围为12000～4000cm-1，分辨率16cm-1，扫描次数32次，每份样品至少采集2次光谱，利用积分球聚集光信号，InGaAs检测器检测，取其平均光谱作为样品原始光谱。优选地，所述步骤(2)中对光谱数据进行预处理包括多元散射校正(MSC)、矢量归一化(SNV)、减去一条直线、一阶导数和二阶导数，最终在12000～4000cm-1范围内进行平滑17个点，选定二阶导数作为建模预处理方式。有益效果：二阶导数可有效的消除噪声、线性基线偏移和其他背景的干扰，分辨重叠峰，提高光谱分辨率和灵敏度，从而达到鉴别光谱的目的。优选地，所述步骤(3)中向灵芝三萜含量最低的醇提物中添加灵芝酸A建立校正集样品构建定量模型，配制精确浓度的灵芝酸标准液0.86mg/mL，取适量标准液，挥干溶剂后与醇提物样品混合均匀，每添加一次灵芝酸A采集2～3次样品的近红外光谱，添加灵芝酸A0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于NIR光谱定量测定灵芝子实体中总三萜的方法，其特征在于：包括以下步骤：/n(1)制备灵芝子实体醇提物：热水浸提灵芝子实体后，收集沉淀，将沉淀冷冻干燥后加入无水乙醇，超声萃取，离心，收集滤液，滤液经减压浓缩后，加入水悬浮浓缩液，石油醚萃取脱脂后蒸干，加入无水乙醇溶解粗提物，经纯化和冷冻干燥后制得灵芝子实体醇提物干粉；/n(2)采集灵芝醇提物的NIR光谱，波数范围为12000～4000cm

【技术特征摘要】
1.一种基于NIR光谱定量测定灵芝子实体中总三萜的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)制备灵芝子实体醇提物：热水浸提灵芝子实体后，收集沉淀，将沉淀冷冻干燥后加入无水乙醇，超声萃取，离心，收集滤液，滤液经减压浓缩后，加入水悬浮浓缩液，石油醚萃取脱脂后蒸干，加入无水乙醇溶解粗提物，经纯化和冷冻干燥后制得灵芝子实体醇提物干粉；
(2)采集灵芝醇提物的NIR光谱，波数范围为12000～4000cm-1，收集光谱数据，对光谱数据进行预处理；
(3)将灵芝子实体醇提物分为校正集和验证集，校正集样品制备方法是在三萜含量最低的灵芝醇提物中添加不同含量的灵芝酸A标准品，利用校正集确定的灵芝酸A含量和测量光谱构建定量模型，选择波数范围为6102～5446.3cm-1和4605.4～4242.8cm-1，建立基于偏最小二乘的三萜分析模型；
(4)将验证集的测量的光谱导入上述三萜分析模型，对照利用高效液相色谱法测定验证集的结果，利用所构建的模型进行结果预测。


2.根据权利要求1所述的基于NIR光谱定量测定灵芝子实体中总三萜的方法，其特征在于：所述灵芝子实体醇提物的制备方法包括以下步骤：将灵芝子实体切片粉碎，并过100目筛，称取灵芝子实体粉末，加ddH2O，料液比为1：40，于80℃水浴3h，离心去除上清，ddH2O洗涤沉淀，收集沉淀，冷冻干燥后获得灵芝子实体粉末，加无水乙醇，料液比1：50，采用超声辅助萃取法，超声萃取90min，静置过夜后，离心，滤液减压浓缩，加水悬浮浓缩液，石油醚萃取脱脂后蒸干，加入无水乙醇溶解粗提物，过0.22μm微孔有机相滤膜，滤液加入4倍体积ddH2O混悬，冷冻干...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄青，张倩倩，
申请(专利权)人：中国科学院合肥物质科学研究院，
类型：发明
国别省市：安徽;34