抗衰老组合物及其制备方法与应用技术

本发明专利技术提供一种抗衰老组合物及其制备方法与应用。所述抗衰老组合物是将脐带间充质干细胞因子提取液与营养成分复配后冻干制得的。所述干细胞因子提取液是将培养获得的脐带间充质干细胞进行细胞裂解，离心收集上清液得到的，其中所含内容物种类丰富，抗衰老及美容护肤效果更好。本发明专利技术使用无血清培养基对脐带间充质干细胞扩增培养后收集细胞裂解物质用于面部年轻化产品，保证了产品使用安全性。

【技术实现步骤摘要】
抗衰老组合物及其制备方法与应用
本专利技术涉及生物制品领域，具体地说，涉及一种抗衰老组合物及其制备方法与应用。
技术介绍
干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞。成体干细胞在临床上具有广泛的应用前景，特别是脐带来源的间充质干细胞。干细胞在生长、增殖、分化过程中，细胞内会分泌大量的细胞因子，其中包含多种生长因子，例如表皮生长因子(EGF)、成纤维细胞生长因子(FGF)、角质细胞生长因子(KGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、转化生长因子-β(TGF-β)以及一些相关的胶原蛋白等活性物质，而这些因子都会参与不同组织及反应的机制中。细胞因子具有多种功能，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥重要作用。细胞因子能促进皮肤组织的生长繁殖；能促进与皮肤损伤有关细胞的快速生长繁殖，并调节细胞间基质的合成、分泌及分解；能促进角质层细胞的再生，加速皮肤角质层和基质层的修复，促进人体皮肤细胞的生长；能增强皮肤细胞的蛋白质的合成和细胞代谢，具有延缓皮肤细胞衰老、促进表皮细胞的修复和生长作用，使皮肤光滑丰润。间充质干细胞的来源广泛，易于分离培养，作为干细胞抗衰老产品的种子细胞极具优势。然而，传统的间充质干细胞培养方法使用的培养基大多含有动物血清，使用时存在不安全因素。传统的间充质干细胞培养方法还存在传代周期长，有效代次低等缺点，例如利用含10％FBS的DMEM-F12培养基培养脐带间充质干细胞，传代周期3-5天，传代比例1:2或1:3，有效代次约15代。此外，目前细胞因子大多来自干细胞培养液，而包含细胞因子等其它活性成分在内的细胞内容物未能有效释放到培养液中。目前，以细胞因子为主要活性成分的抗衰老产品大多以液态或乳液形式存在，不利于存储，亟需开发适于长期保存的新剂型。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗衰老组合物及其制备方法与应用。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供抗衰老组合物的制备方法，包括：1)脐带间充质干细胞进行体外培养；2)收集培养得到的脐带间充质干细胞，进行细胞裂解，得到细胞裂解液；细胞裂解液经离心得到上清液，作为干细胞因子提取液；3)将干细胞因子提取液与营养液按比例混合，得原液；4)将原液与冻干保护剂按比例混合，冷冻干燥。所述营养液为：维生素C10-50ug/ml、透明质酸钠1-5mg/ml和人转铁蛋白1-10ug/ml。所述冻干保护剂为：甘露醇50-150g/L、海藻糖1-10g/L和右旋糖酐405-15g/L。步骤1)中使用的细胞培养基为：含有重组人胰岛素1-100ug/ml、人转铁蛋白1-50ug/ml和亚硒酸1-80ug/ml的DMEM培养基。优选地，所用细胞培养基为：DMEM+重组人胰岛素5ug/ml+人转铁蛋白5ug/ml+亚硒酸7ug/ml。培养条件为：36.5～38℃(优选37℃)，5％CO2。脐带间充质干细胞采用贴壁培养，待细胞长满至85％～90％(优选90％左右)，消化并收集细胞。脐带间充质干细胞选用P3～P22代(优选P8-P12代，更优选P9代)中的至少一种。步骤2)包括：收集培养得到的脐带间充质干细胞，向1000万IU细胞中加入0.1-1mL生理盐水重悬，置于离心管内，再放入-60℃～-80℃(优选-80℃)冰箱中反复冻融(每次需置于37℃恒温水浴锅解冻)，然后超声破碎细胞，得到的细胞裂解液经筛网(筛网孔径20-40um)过滤，所得滤液于4℃，10000rpm离心15min，收集上清液。优选地，超声功率为400-650W，频率为20-25KHz，每次超声5-10s，共超声5次。步骤3)将干细胞因子提取液与营养液按2-3:2-3的体积比混合。步骤4)将原液与冻干保护剂按0.8-1.2:8.5-9.5的体积比混合。优选地，冷冻干燥的温度为-60℃～-80℃，冻干机预冻4h-8h，然后真空冷冻48h-72h。步骤1)之前还包括从脐带组织中分离出脐带间充质干细胞，并进行培养、传代。步骤2)还包括对培养得到的脐带间充质干细胞进行干细胞标志物鉴定。所述干细胞标志物包括CD29、CD44、CD73、CD90、CD105等。步骤2)还包括对干细胞因子提取液中的细胞因子进行检测(质控)。第二方面，本专利技术提供按照所述方法制备的抗衰老组合物。第三方面，本专利技术提供所述抗衰老组合物的以下任一应用：a)用于制备面部年轻化生物制品；b)用于制备美容祛斑护肤品；c)用于制备表皮细胞修复制剂；d)用于皮肤抗衰老修复、美容及淡化色斑；e)促进皮肤再生和皮肤创面愈合。第三方面，本专利技术提供一种抗衰老美容护肤品，有效成分为所述抗衰老组合物。所述抗衰老组合物可以通过纳米晶或纳米针导入肌肤。使用时，用9％生理盐水将所述抗衰老组合物冻干粉溶解，均匀滴在皮肤上，使用纳米晶或纳米针进行导入操作，多余的残留液可继续按摩至完全吸收。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：(一)本专利技术使用无血清培养基对脐带间充质干细胞扩增培养后收集细胞裂解物质用于面部年轻化产品，保证了产品使用安全性。(二)采用本专利技术的间充质干细胞培养方法，传代周期2-3天，传代比例1:10，有效代次22代，代次效率高。(三)脐带间充质干细胞通过冻融、超声破碎得到细胞裂解原液，其内容物种类丰富，操作简单、有效。附图说明图1为本专利技术较佳实施例中细胞增殖数量比较。图2为本专利技术较佳实施例中细胞融合度图。图3为本专利技术较佳实施例中实验组1产品使用效果图。图4为本专利技术较佳实施例中实验组2产品使用效果图。图5为本专利技术较佳实施例中实验组3产品使用效果图。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。实施例1抗衰老组合物冻干粉的制备1、脐带间充质干细胞的培养(1)脐带组织取自健康剖宫产或自然分娩的孕妇，产妇本人签署知情同意书。在剪断连接婴儿端和母亲的脐带后，立刻用脐带夹夹住，防止内部污染。装入无菌袋中，4℃保存，24h内进行脐带间充质干细胞的分离与培养。(2)在超净工作台内取出脐带，连同脐带夹用含有75％酒精泡2min(150mm培养皿中)。(3)用酒精预处理完，迅速移入生理盐水中浸泡清洗2次，每次2min即可。(4)剪掉脐带夹，将脐带剪成长度1-3cm小段，用剪刀从脐静脉内侧剖开脐带，用带齿镊子将脐静脉、脐动脉以及脐带包膜去除，防止杂细胞混入。(5)用剪刀剪碎脐带组织，放入50ml离心管中加入0.1％Ⅱ型胶原酶(稀释液用DMEM/F12)置于37℃培养箱内消化30min，每15min摇晃1次。(6)将离心管本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.抗衰老组合物的制备方法，其特征在于，包括：/n1)脐带间充质干细胞进行体外培养；/n2)收集培养得到的脐带间充质干细胞，进行细胞裂解，得到细胞裂解液；细胞裂解液经离心得到上清液，作为干细胞因子提取液；/n3)将干细胞因子提取液与营养液按比例混合，得原液；/n4)将原液与冻干保护剂按比例混合，冷冻干燥；/n所述营养液为：维生素C10-50ug/ml、透明质酸钠1-5mg/ml和人转铁蛋白1-10ug/ml；/n所述冻干保护剂为：甘露醇50-150g/L、海藻糖1-10g/L和右旋糖酐40 5-15g/L。/n

【技术特征摘要】
1.抗衰老组合物的制备方法，其特征在于，包括：
1)脐带间充质干细胞进行体外培养；
2)收集培养得到的脐带间充质干细胞，进行细胞裂解，得到细胞裂解液；细胞裂解液经离心得到上清液，作为干细胞因子提取液；
3)将干细胞因子提取液与营养液按比例混合，得原液；
4)将原液与冻干保护剂按比例混合，冷冻干燥；
所述营养液为：维生素C10-50ug/ml、透明质酸钠1-5mg/ml和人转铁蛋白1-10ug/ml；
所述冻干保护剂为：甘露醇50-150g/L、海藻糖1-10g/L和右旋糖酐405-15g/L。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中使用的细胞培养基为：含有重组人胰岛素1-100ug/ml、人转铁蛋白1-50ug/ml和亚硒酸1-80ug/ml的DMEM培养基；和/或
培养条件为：36.5～38℃，5％CO2；和/或
脐带间充质干细胞采用贴壁培养，待细胞长满至85％～90％，消化并收集细胞；和/或
脐带间充质干细胞选用P3～P22代中的至少一种。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)包括：收集培养得到的脐带间充质干细胞，向1000万IU细胞中加入0.1-1mL生理盐水重悬，置于离心管内，再放入-60℃～-80℃冰箱中反复冻融，然后超声破碎细胞，得到的细胞裂解液经筛网过滤，所得滤液于4℃，...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘诚，马雅婷，高锦颐，
申请(专利权)人：西安世越再生医学研究中心有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61