一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱制造技术

一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱是将均三嗪类染料通过带易水解基团的硅烷衍生物的偶联剂键合到石英或玻璃毛细管管壁上而制成的电泳柱。该柱对一系列重要酶具有很高选择性。此外，所提供方法还可以作为一种柱改性方法，用于普通肽、蛋白质的毛细管区带电泳分离，其柱效、对称性、重复性和寿命等基本参数都达到其它改性柱的水平。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供一种对一素列重要的酶，例如乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、已糖激酶、核糖核酸酶等具有很高选择性的均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱及其制备方法。该电泳柱也可以用于普通蛋白质和肽等高分子物质的分离。毛细管电泳技术在80年代后期崛起，它使传统的电泳过程在25～100μm内径的毛细管内实现，具有前者无法比拟的高效、快速、微量和自动化的特点。亲和电泳是利用大分子所具有的专一的亲和力而设计的电泳技术，通常把在毛管内实现的亲和电泳技术称之为毛细管亲和电泳。与本专利技术的技术较为接近(Anal.Chem.1991.63.2038～2042)曾报导在凝胶(聚丙烯酰胺)中加入一种可溶性配基以提高选择性。但是作为该技术基础的凝胶栓，需要向柱内灌入丙烯酰胺并使之聚合，制备困难又难以重复。同时所提供技术还不能对一些酶提供一定的选择性。本专利技术的目的是提供一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱及这种电泳柱的制备方法。利用该柱可对一系列重要的酶，例如乳酸脱氢酶、醇脱氢酶、已糖激酶、核糖核酸酶等具有很高的选择性，同时又能用于普通蛋白质和肽等高分子物质的分离。本专利技术借鉴亲和色谱，亲和电泳技术，考虑到毛细管电泳的各种性能，将三嗪染料通过偶联剂键合到电泳毛细管的管壁上，而制成均三嗪染料亲和毛细管电泳柱。本专利技术的电泳柱可用下结构式(1)表示 上结构式(1)中，B为毛细管壁; 为偶联剂与石英或玻璃毛细管的管壁Sl元素键合的偶联剂基团，偶联剂可用结构式(2)表示 式(2)所表示的偶剂是指带有易水解基团的三取代的硅烷衍生物，其中X为易水解基团，如烷氧基(三甲氧基、三乙氧基等)或氯、水解后通常生成硅醇。Y为相应的有机管能团，如乙烯基、甲基、氨丙基、烯丙基、甲基丙烯酸丙酯基及乙二胺基等。结构式(1)中-Z为均三嗪类染料基团，具体地说为含有三嗪杂环的一类染料，而杂环通常是氮杂环，如二氯均三嗪和一氯均三嗪类，可用下结构式(3)、(4)及(5)表示一氯均三嗪类 止式中D为染料生色体系，如葱醌环、苯磺酸基或萘磺酸基等，其典型的化合物及国际通用名称如，汽巴蓝(Clbacron Blue，F3G-A)，普施安蓝(Proclon Blue MX-R)及普施安黄(Proclon Yellow，HA)。本专利技术均三嗪染料亲和毛细管电泳柱的制备方法是按下述步骤1、取一定内径(25～100μm)的石英或玻璃毛细管，分别用碱(KOH或NaOH)和无机酸(HNO3，HCl，H2SO4)进行洗涤;2、然后将硅烷类偶联剂水溶液用真空泵抽入毛细管内，偶联剂溶液在管内和管壁进行反应，时间应不少于15分钟，最好为1～5小时，偶联剂将与管壁中Sl元素形成Sl-O键，使偶联剂键合在毛细管壁上;3、将均三嗪染料溶液通入毛细管，在管内染料将和偶联剂反应，反应时间应不少于1小时，染料基团(结构式(3)～(5))将与偶联剂键合，即通过偶联剂使均三嗪染料键合到毛细管的管壁上。再经水洗，用惰性气体吹干可制成本专利技术的电泳柱。在上述碱、酸洗涤毛细管时，可采用浓度为1～20%的NaOH或KOH溶液及浓度为1～30%无机酸作洗涤液，偶联剂可采用浓度为0.01～5%的溶液，而染料可采用浓度为0.01～0.1M的溶液。下面通过实施例对本专利技术的技术给予进一步地说明。实例1均三嗪染料亲和毛细管电泳柱的制备1先后用5%KOH和10%的HCl洗柱，各半小时，每次洗完后用两次水冲3分钟，用丙酮脱水、氮气吹干，把r-缩水甘油醚基丙基三甲氯基硅烷水溶液通入柱子逾5分钟，后再静止15分钟，再通氮气20分钟以吹去残余偶联剂，用2%HCl冲柱10分钟，水洗至中性，再把0.01ml/L的Clbacron蓝F3G-A通入柱内2小时，水洗至滴出液无色，即可供电泳使用。实例2电泳柱的制备2柱子预处理过程和所用偶联剂同例1，用0.005mol/L的Prlclon蓝MX-R溶液代替Clbacron蓝参与反应，清洗过程仍和例1相同。实例3电泳柱制备3柱子预处理过程同实例1，用r-氨丙基三乙氯基硅烷代替r-缩水甘油醚基丙基三甲氯基硅烷，完成管壁的硅烷化反应，仍用0.01mol/L的Clbacron蓝F3G-A通入柱内反应，其余过程同例1。实例4亲和柱的选择性实验用按上述实例1制备的亲和毛细管柱对核糖核酸酶的迁移值进行测定，用胰酶和牛血清白蛋白作对照样品，用未涂渍柱作为对照柱，在同样的操作条件下核糖酸酶在亲和柱和空白柱上淌度的变化远远大于对照样品(胰酶和牛血清白蛋白)在相应柱上的变化。μ为扣除电渗后的电泳淌度计算方法如下μ＝ (QL)/(V) ( (l)/(t) - (l)/(t) 。)其中Q为柱的有效长度L为柱总长度V为运动电压t为样品迁移时间t。为测电渗用的二甲基亚砜迁移时间操作条件进样电压12KV时间12秒运行电压10KV缓冲液PH6.830.1M磷酸盐柱总长54.8cm(亲和柱)内径50μm检测紫外200nm0.01AUFS仪器HPE-100(Blo-Rad)实例5亲和柱的性能实验除此之外，上述亲和柱还具有一段涂渍柱的通用性，即能作为改性柱用于毛细管区带电泳操作模式下，肽和蛋白的分离，柱效、对照性、重复性和寿命均佳。表3为一组标准肽的基本性质，附图说明图1为标准肽在实例2所制亲和柱上的谱图，表4为各组分的柱效和拖尾因子，表5为三次恒压操作所得的相对标准偏差值，此柱在PH2.5下运行50余次，在PH6.83下运行100余次，仍未见柱性能下降迹象。图1所示为标准肽在实例2所制亲和柱上的谱图中操作条件为进样电压10KV时间6秒运行电压10KV缓冲液PH2.50.1M磷酸盐;检测紫外200nm，0.01AuFs仪器HPE-100(Blo-Rad)毛细管内径50μm毛细管柱长31.4cm。上述实例，本专利技术提供的亲和毛细管电泳柱对酶具有很高的选择性，也可作为微制备的手段。同时该电泳柱的制备过程简单有效。此外，本专利技术还可作为一种亲的柱改性方法，用于普通肽、蛋白质的毛细管区带电泳分离，其柱效、对称性、重复性和寿命等基本参数都达到其它改性柱的水平。权利要求1.一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱，是将均三嗪类染料通过偶联剂键合到毛细管的管壁上，其特征在于电泳柱的结构可用下结构式表示其中B为石英或玻璃毛累管壁；为偶联剂基团，偶联剂为带易水解基团的三取代的硅烷衍生物，可用下结构式表示其中，X为易水解基团，如烷氧基或氯；Y为有机管能团，如乙烯基、甲基、氨丙基、烯丙基、甲基丙烯丙酯基及乙二胺等，-Z为均三嗪类染料基团，如二氯均三嗪或一氯均三嗪类。可用下结构式表示其中D为染料生色体系，如葱酯环基、苯磺酸基或萘磺酸基等。2.按照权利要求1所述的电泳柱，其特征在于毛细管是采用内径为25～10μm的石英或玻璃毛细管。3.一种用于按照权利要求1所述电泳柱的制备方法，包括对毛细管柱的碱和酸洗涤及涂有机相，其特征在于(1)毛细管经碱和酸洗涤后，将硅烷类偶联剂水溶液用真空泵抽入毛细管内，偶联剂在管内和管壁进行反应时间应不少于15分钟;(2)再将均三嗪染料溶液通入毛细管，使染料与偶联剂进行反应，其时间应不少于1小时，然后经水洗用惰性气体吹干。4.按照权利要求3所述的制备方法，其特征在于偶联剂可采用浓度为0.01～5%的溶液，染料可采用浓度为0.01～0.1M的溶液。全文摘要一种均三嗪本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种均三嗪类染料亲和毛细管电泳柱，是将均三嗪类染料通过偶联剂键合到毛细管的管壁上，其特征在于电泳柱的结构可用下结构式表示：＊＊＊其中：Ｂ为石英或玻璃毛累管壁；＊＊＊为偶联剂基团，偶联剂为带易水解基团的三取代的硅烷衍生物，可用下结构式表示：＊＊＊其中，Ｘ为易水解基团，如烷氧基或氯；Ｙ为有机管能团，如乙烯基、甲基、氨丙基、烯丙基、甲基丙烯丙酯基及乙二胺等，－Ｚ为均三嗪类染料基团，如二氯均三嗪或一氯均三嗪类。可用下结构式表示：染料基团：＊＊＊一氧均三嗪类：＊＊＊二氯均三嗪类＊＊＊其中Ｄ为染料生色体系，如葱酯环基、苯磺酸基或萘磺酸基等。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：林炳承，褚新华，杨一，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]