检测核酸的方法技术

利用核酸探针检测核酸的方法，包括样品与荧光标记的ＲＮＡ探针混合，ＲＮＡ探针在其末端用荧光标记来标记并具有单链靶ＤＮＡ的互补序列，因此样品与靶ＤＮＡ杂交，之后加入核糖核酸酶Ｈ与杂合体反应，核糖核酸酶Ｈ特异性的降解ＤＮＡ－ＲＮＡ杂合体中的双链ＲＮＡ，所以形成ＲＮＡ探针片段并释放下来。而ＲＮＡ探针再与恢复单链形成的靶ＤＮＡ杂交，然后以同样的方式用核糖核酸酶Ｈ降解。反应过程自动重复，通过重复释放大量的ＲＮＡ探针片段，终止反应后，反应液经电泳来确定降解的ＲＮＡ片段。用这种方法，ＤＮＡ或可以被高灵敏度地检测出来。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是关于检测RNA或DNA的方法，也涉及DNA(基因)诊断。DNA或RNA的检测被用于诊断遗传病和病毒性传染病。对于一些稀有的病例来说，被检测的病毒拷贝数只有几十个或更少，因此利用PCR(聚合酶链反应)或NASBA(核酸碱基序列扩增;Na-ture，350，91-92(1991)扩增DNA或RNA的方法已用于病毒的检测。用PCR和NASBA方法，分别扩增特定的DNA区域或特定的RNA区域，例如，用PCR法，扩增的DNA区域位于与目标双链DNA(+)链和(-)链杂交的两个寡聚物之间。双链DNA在高温(90℃)下变性，使(+)链和(-)链分开，随后降低温度(60℃)，用像Taq这样的热稳定的DNA聚合酶，DNA寡聚物与单独的链杂交合成互补链，再升高温度使(+)链和(-)链分开。通过重复升温和降温循环，DNA链成二倍增殖。已知经过这样一次热循环，大约扩增1.6倍，所以经过30次重复拷贝数扩增至106倍。在凝胶电泳上分离以这种方式合成的DNA并分析扩增的DNA的长度，来检测靶DNA存在与否。这样的PCR方法有缺点，它需要昂贵的热稳定酶来扩增DNA拷贝，需要一个系统来重复升温和降温，工作烦琐和费时，并且DNA扩增需要二个寡聚物(引物)。此外，PCR产物需在电泳上分离，需要艰苦的工作和劳动，特别在某些情况下，扩增目标的两个引物很难选定。本专利技术的目的就是解决这些缺点并提供一个取代PCR的简单和高度灵敏地检测DNA或RNA方法，同时也提供采用此方法的DNA(基因)诊断。本专利技术的第一方面包括用荧光标记的RNA寡聚物或DNA-RNA共聚体作为探针。这样的寡聚物或共聚物与靶DNA杂交，用核糖核酸酶降解DNA-RNA双链部分，检测缩短的探针从而检测靶DNA(核酸)的存在，本专利技术也阐述了所用的探针的特性，探针具有DNA和RNA结合部份重复二次以上的结构并且在重复的DNA部分有一个荧光标记位点;或者至少在探针一端具有固相化的颗粒的RNA链，此RNA链与靶DNA杂交，RNA链位于探针固相化颗粒位点和荧光标记位点之间。RNA探针和RNase(核糖核酸酶H等)加到样品溶液中，只有当目标(互补部分)DNA序列存在时RNA探针才形成DNA-RNA杂合体。因为RNase只降解杂合体的RNA区域，所以RNA探针被缩短并从靶DNA链、上释放下来，靶DNA链再与RNA探针杂交。之后，没有反应的RNA探针与样品溶液中的DNA杂交，接着用RNase缩短RNA探针。反应(杂交和降解)可以在37℃重复进行，所以当样品溶液中存在与RNA探针有互补序列的DNA时，形成了比DNA数量大许多的缩短的RNA探针。通过分析缩短的RNA探针可以检测出痕量目标DNA。当用DNA-RNA共聚物做探针时，只有探针的RNA部分被降解，因为缩短的DNA寡聚物不再有较强的结合力，所以荧光标记的缩短的DNA寡聚物从靶DNA链上释放下来。因此，重复杂交反应和降解反应形成大量的荧光标记的缩短的DNA寡聚物并释放下来，所以靶DNA可以高灵敏度地检测出来。当具有多个DNA部份并且在多个重复的DNA部份有荧光标记位点的DNA-RNA共聚物作探针时，只有探针的RNA部份被降解，因此探针以DNA部份与靶DNA链杂交的形式被修饰成片段寡聚物。如果DNA部分的长度足够短，因其结合力太弱而从靶DNA链上释放下来，这样就形成多个荧光标记的缩短的DNA探针并从上述探针中释放出来。杂交和降解，然后释放缩短的DNA探针过程重复进行。把所用探针的DNA部分制备成相等长度，在电泳分离时所有释放的DNA可检测成一个峰，这样靶DNA的存在以高灵敏度检测出来。利用上述任何一种RNA探针，由DNA-RNA共聚物构成的探针和具有荧光标记位点的多个重复DNA部分结构的探针，将探针一端固相化在颗粒上，而可与靶DNA杂交的RNA链位于探针固相化部位和荧光标记位点之间，从而形成探针和靶DNA杂合体。由于RNase裂解杂合体中的RNA部份，当用磁珠作为这种颗粒时，裂解反应后没有裂解的探针可用磁铁快速除去，而含有荧光标记的裂解探针仍留在容器中。通过测量荧光标记位点上的标记荧光产生的荧光，很容易检测样品DNA。为了检测痕量靶DNA，与靶DNA杂交的核酸探针要以高灵敏度检测出来。当含有RNA的标记探针与特异地降解DNA-RNA双链的RNA(杂交瘤)的核酸酶(如核糖核酸酶H等)共存时，只降解与靶DNA形成杂合的探针并改变探针长度的反应被称为靶DNA催化反应，酶作为催化剂，反应探针的降解不可逆地进行。因此即使只有痕量靶DNA存在，仍产生大量的降解和修饰探针，这样获得高灵敏的DNA检测结果。用凝胶电泳根据分子大小从没有反应的探针中分离降解的探针，把探针固相化在颗粒或磁珠上，可以用非常简单的方式从完整的探针中分离降解产物。本专利技术方法不同于常规的PCR及其相似的方法。只要简单地把探针和酶加到样品中，因而本专利技术的方法是高度有效的，因为反应系统可被简化。下文将叙述本专利技术的第二个方面。用核酸寡聚物(核酸探针)进行DNA分析，与靶DNA杂交的DNA或RNA探针被降解，其长度因此被缩短。然后，完整的探针或部分缩短的探针从反应液中除去。用一种具有核酸外切酶活性或一种核糖核酸酶H活性的酶，或者这二种酶一起来缩短与靶DNA杂交的DNA或RNA探针。DNA探针由二条链组成，第一条链部分具有像荧光团这样的化学品标记的位点、第二条链具有像生物素这样的化学品标记的位点，后者用来从没有反应的探针中分离降解的DNA探针。像生物素这样的分离标记可以通过抗生物素蛋白或抗生蛋白链菌素连到磁珠上。DNA探针与靶DNA杂交后，用像核酸外切酶或核糖核酸酶H这样的酶使第一条链部分和第二条链部分分开，与磁珠相连的抗生物素蛋白与生物素结合，之后用磁珠除去完整的(没有反应的)DNA探针。而保留下来的带有检测标记的缩短的探针可以被检测。电磁场和磁珠一起使用或使用分子筛膜，除去完整的或部分缩短的探针。所用的探针第一条链部分含有一个用于检测的标记化合物，第二条链部分含有一个固相化的分离标记的位点，此位点用于检测反应后欲从溶液中除去的反应物和反应产物。此外在探针缩短反应期间，探针的两部分互相分离。用于检测的标记材料可以选自荧光团，化学发光物、染料和分散剂如颗粒。用于分离的标记物可以选自生物素、磁珠和颗粒。另外，探针具有一个标记区域，这一区域在离5′末端6个碱基之内至少有一个检测标记;在离检测标记10个碱基之内趋向于3′末端方向有一个生物素标记;在探针3′末端有一个至少含5个或更多碱基的DNA链。同样探针可能具有一个标记区域，这一区域在离5′末端6个碱基之内至少有一个检测标记，在离检测标记10个碱基以内趋向于3′末端方向有一个生物素标记;在探针3′末端有至少含5个碱基的DNA链，而且，在标记区域和3′末端DNA链之间，探针至少有一处含有RNA链，此处3′末端被阻断以防止核酸外切酶降解。下面将讨论总长32-mers的DNA嵌段共聚物探针。作为DNA探针，在5′末端有荧光标记，离5′末端第十个核酸上有生物素标记，DNA从生物素标记向3′末端延长了10个核苷酸，接着是6-mers的RNA部份，之后是6-mer或更长的DNA部份。此DNA部份被固相化在颗粒上。当探针加到含有靶DNA的D本文档来自技高网...

【技术保护点】
利用核酸探针检测核酸的方法，包括：（ａ）核酸与样品杂交的步骤，（ｂ）用核糖核酸酶降解与样品杂交的核酸探针的步骤，（ｃ）为检测靶核酸而检测步骤（ｂ）形成的降解产物的步骤。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：神原秀记，冈野和宣，川本和子，古山宏子，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]