牛免疫缺陷病毒检测试剂盒制造技术

ＢＩＶ是牛艾滋病的病原体，其感染牛以后，牛血液中会出现ＢＩＶ特异性ＩｇＧ抗体。通过检测血清中的ＢＩＶ抗体，可判断是否被ＢＩＶ感染。本发明专利技术的ＢＩＶ检测技术包括：免疫酶法（ＩＥ）ＢＩＶ检测试剂盒和蛋白印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）ＢＩＶ检测试剂盒两项内容。本技术具有准确、快速、微量及操作简单等优点，可用于海关、牧区检疫，以控制牛艾滋病（ＢＡＩＤＳ）的蔓延，同时也可用于牛血清制品的ＢＩＶ检测，以保证用于人畜的生物制品的安全性。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于动物传染病诊断技术。牛免疫缺陷病毒(BIV)即牛艾滋病毒，该病毒在欧美和日本均有传播，据查感染率约为1.4-4%。每年都要造成重大经济损失。另外，BIV与人艾滋病毒(HIV)有很高的同源性，牛血清制备的人用生物制品具有潜在的危险性。因此，及时准确地检测出BIV，避免其传播和感染具有十分重要意义。关于BIV检测技术，目前只有美国三个实验室从1990-1991年先后建立了反转录酶分析(RTassay)和合胞体形成(SyncytiaFormation)等方法。上述方法耗时较长，准确度不够高，均不适于大批量样品的检测。近来发展起来的血清学方法，如蛋白印迹法(Westernblot)为BIV的检测奠定了基础。但尚未形成完整的试剂盒检测技术。本专利技术的特点包括两个BIV检测试剂盒，即免疫酶法(IE)BIV检测试剂盒和蛋白印迹法(Westernblot)BIV检测试剂盒。一.免疫酶法(IE)BIV检测试剂盒包括1.抗原玻片将被BIV感染的细胞固定在玻片上圆形小槽内，即被感染的细胞中含有BIV核心蛋白(抗原，gag-p26)。2.阳性对照为被BIV感染的牛血清的冻干制剂。3.阴性对照为未被BIV感染的牛血清制剂。4.酶标抗体用辣根过氧化物酶(HRPO)标记兔抗牛IgG血清冻干制剂。5.洗液为20mMTris10mMNaCl的缓冲液(pH8.0)。(使用前用蒸馏水稀释25倍)6.显色液A液(20ml磷酸NaCl缓冲液+12μl 30% H2O2)和B液(4ml甲醇+12mg 4-氯-1-萘酚)组成。用前混合使用。检测时，将稀释的被测血清样品滴加入抗原玻片上的圆形小槽内，在37℃温育45分钟，使含BIV特异抗IgG抗体被选择性地结合在小槽内抗原上，形成抗原-抗体复合物，用洗液漂洗3次，每次2-3分钟，再以重蒸水洗一次，除去非特异性IgG后，吹干。然后滴加酶标抗体，经过第二次温育，37℃，30分钟，酶标抗体(二抗)与抗原抗体复合物中的BIV特异IgG结合。用洗液漂洗3次，每次2-3分仲，用重蒸水洗一次，洗去未结合的酶标抗体后，将抗原玻片浸泡于显色液中，显色10-15分钟，取出用重蒸水漂洗净，沥干。同时与样品同步做阳性对照和阴性对照的平行检测。在显微镜下观察结果，以中心视野为准，细胞膜和细胞浆呈兰紫色者为阳性细胞，无色者为阴性细胞。发现阳性细胞者，重测一遍，仍有阳性细胞者定为阳性。利用本试剂盒对BIV进行检测，简便快速，还由于直接将被感染的细胞固定于玻片上圆形小槽内，省去了抗原纯化制备等过程，成本低适于大规模普查。二.蛋白印迹法(Westernblot)BIV检测试剂盒本试剂盒包括(1)抗原片由高表达载体pNK10(E.coliRRI)所表达的BIV核心蛋白(trpE-p26)为抗原。该载体的表达量达细胞总蛋白量的28%。用蛋白印迹法经电泳分离、电转移，将抗原蛋白转印至硝酸纤维素膜(NC)上。使用时将NC膜切成2mm宽条片;(2)阳性对照;(3)阴性对照;(4)酶标抗体;(5)洗液;(6)显色液;(2)至(6)的组成均与免疫酶法(IE)试剂盒相同;(7)反应槽包括由十几个小型反应槽(0.8×1×0.5)组成。检测时将NC膜小条片放入小反应槽内，加入适量的洗液，再按1/10量加入稀释后的血清样品。同时做阳性对照和阴性对照各一份，在37℃温育45分钟，经漂洗3次，每次5分钟，沥干后，每小反应槽加0.5ml洗液，再加入1/25量的酶标抗体，在37℃下温育30分钟。再漂洗3次，最后每反应槽加0.4ml显色液，37℃下反应，直至阳性对照槽内NC膜上有兰紫色反应带出现，除去显色液，用蒸馏水洗一遍，阳性对照反应槽中NC膜上有一条兰紫色反应带。阴性对照NC膜上则无此带。如样品反应槽中NC膜上有兰紫色反应带则确认为阳性。本试剂盒对BIV进行检测操作简便，灵敏度高，被测样品用量小，每个样品约10微升即可。本专利技术的两套BIV检测试剂盒，均可分别用于大批量样品的检测。由于检测准确可靠，可对BIV感染的个体做出早期诊断。实例1将被测牛血清样品液(约10微升)滴加在抗原玻片上，相应的圆形小槽内，37℃温育45分钟，用洗液漂洗3次，每次2-3分钟，再用重蒸馏水洗一次，吹干。每圆形小槽滴加适量酶标抗体液，在37℃温育30分钟，再用蒸馏水漂洗3次，最后将抗原玻片浸泡于显色液中显色10-15分钟，取出用重蒸水漂洗净，沥干。同时做阳性对照和阴性对照。在显微镜下观察结果，以中心视野为准，细胞膜和细胞浆为兰紫色者视为阳性。无色者视为阴性。实例2将NC膜抗原片剪成约2mm宽的小条片分别放入小反应槽内，每槽加洗液0.5ml，按1/10加入血清样品。同时平行做阳性对照和阴性对照。在37℃温育45分钟，用洗液漂洗3次，每次5分钟，沥干后，每槽重新加入洗液0.5ml按1∶25加入酶标抗体，在37℃下温育30分钟，再用洗液漂洗3次，最后每反应槽加入0.4ml显色液，在37℃下反应直至阳性对照的NC条有兰紫色反应带时，弃显色液，用蒸馏水洗一次。结果判断阳性对照的NC膜条上呈现一条兰紫色反应带，阴性对照则无此带。如加样品血清的NC膜条上有兰紫色反应带时，则确认为阳性血清。无兰紫色反应带者为阴性。参考文献1.MatthewAGondaetalNature，330∶383-391，1987.2.AtkinsonBetalJViralMethods，36∶35，1992.3.HorjzinekMetalJGenViral，72(12)∶2923，1991.4.GarreyKJetalVirology，175∶391，1990.权利要求1.一种用于检测BIV即牛艾滋病毒的检测试剂盒，其特征在于它包括免疫酶法(IE)BIV检测试剂盒和蛋白印迹法(Western blot)BIV检测试剂盒。2.根据权利要求1中所述的免疫酶法BIV检测试剂盒，其特处在于该试剂盒由抗原玻片，阳性对照牛血清制剂，阴性对照牛血清制剂，酶标抗体制剂，洗液和显色液组成。3.根据权利要求1中所述的蛋白印迹法BIV检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括抗原片，阳性对照牛血清制剂，阴性对照牛血清制剂，酶标抗体制剂，洗液，显色液和反应槽组成。4.根据权利要求1和权利要求2中所述的免疫酶法BIV检测试剂盒中的抗原玻片，其特征在于将被BIV感染的细胞固定在玻片上的圆形小槽内，抗原是被感染细胞中的BIV核心蛋白(gag-p26)。5.根据权利要求1和权利要求3中所述的蛋白印迹法BIV检测试剂盒的抗原片，其特征在于抗原是由高表达载体pNK10(E.coli RRI)所表达的BIV核心蛋白(trpE-p26)。6.根据权利要求2和权利要求3所述的免疫酶法和蛋白印迹法BIV检测试剂盒中的酶标抗体，其特征在于用辣根过氧化物酶(HRPO)标记兔抗牛IgG血清制剂。7.根据权利要求2和权利要求3所述的免疫酶法和蛋白印迹法BIV检测试剂盒中的洗液，其特征在于由20mM Tris 10mM NaCl pH8.0的缓冲液组成。8.根据权利要求2和权利要求3所述免疫酶法和蛋白印迹法BIV检测试剂盒中的显色液，其特征在于A液(20ml磷酸NaCl缓冲液+12微升30%H2O2)和B液(4ml甲醇+12mg 4-氯-1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测ＢＩＶ即牛艾滋病毒的检测试剂盒，其特征在于它包括免疫酶法（ＩＥ）ＢＩＶ检测试剂盒和蛋白印迹法（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）ＢＩＶ检测试剂盒。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：耿运琪，杨丽珠，陈启民，纪永刚，曾毅，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]