血液成分的检测方法及用于检测的物质技术

检体中血液成分的检测方法，其特征是使检体中的人体红血球膜带３糖蛋白和耳霉属微生物所产生的红血球凝集素反应，检测出含在所生成复合物中的该带３糖蛋白。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及特异地检测来自人体血液的方法，更详细地说是涉及能够从粪便检测出消化道中微小出血的血液成分的检测方法，例如用来筛选检查大肠癌等以及用于检测的物质。
技术介绍
检测人体血液的成分，在多方面都是必要的，特别在医疗领域其必要性更高。例如众所周知的，消化道的出血是由各种疾病引起的，特别对消化道的恶性肿瘤，消化道的出血是非常重要的初期症状。检测消化道出血，诊断消化道恶性肿瘤的方法，现在主要是通过测定粪便中的血液成分、特别是血红蛋白来进行的。这种检测粪便中血红蛋白的方法有逆受体血球凝集法、胶乳凝集法、金胶体凝集法、酶免疫鉴定法、放射免疫鉴定法。其原理是调制抗血红蛋白的抗体，使之发生血红蛋白和抗原-抗体反应，再用各种方法测定、检出其结果。但是，这种过去使用抗血红蛋白的抗体的免疫学检测方法，作为被检测物质的血红蛋白，通常要与引起失活的粪便一起提供给检查，所以随着温度和时间的变化血红蛋白的抗原决定基失活，结果检测灵敏度显著地下降。特别夏季高温时，往往引起血红蛋白的改性或分解，本来是阳性的试样可能报告出阴性(藤好建史及小山真理子、“基础和临床”、免疫便潜血试剂的基础研究、23(15)、6097-6101，1989)。而且特别是在血红蛋白低浓度时，上述失活显著，这对于具有诊断意义的低浓度检测造成了困难。因此，本专利技术的目的是提供以下的方法，也就是，即使使用粪便等试样也不易由于温度和保存时间受到影响，可以准确地测定血液成分的方法。本专利技术者对于使用血红蛋白代替血液成分检测粪便等中的血液或血液成分的存在进行了精心的研究，结果发现人体红血球膜带3糖蛋白(以下简称“带3”)即使在粪便等试样中也难于失活，而且与特定的红血球凝集素结合可以形成复合物，所以很容易地检测出，从而完成了本专利技术。即，本专利技术提供了使检体中的带3和属于耳霉属微生物产生的红血球凝集素进行反应，检测生成的复合物来确定检体中血液成分的检测方法及用于此方法的检测物质。本专利技术中，作为血液成分检测出的带3，是红血球的标记，这在文献中报告(Beppu，M.et al.，J.Biol.Chem.256(6)，3226-3233(1990)，＂Binding of anti-band 3 autoantibody to oxidativelydamaged erythrocytes”等)，它是监视红血球作用的成分。另一方面，本专利技术方法中所使用的耳霉属微生物所产生的红血球凝集素(以下称为“CA”)是属于耳霉属，例如由闪表耳霉属(Conidiobolus lamprauges)和短枝耳霉属(Conidiobolusnanodes)等微生物产生的人体特异红血球凝集素，可以和带3之间相互作用，这方面已有报告(Ishikawa，F.et al.，Agric.J.Biol.Chem.45(9)，2105-2110(1981)，＂Action of proteases on humanerythrocyte glycoproteins in relation to hemagglutinationby Conidiobolus chitin-binding agglution＂)，但是使用它检测的方法尚无人知。本专利技术的方法，因为可以检测出含在检测系中血液成分的带3与CA的复合体中的带3，检测出检体中人体血液成分，所以只要达到此目的采用任何方式都可以。作为实施本专利技术方法的一个例子可以举出所谓的夹层法，即将CA作成固相的表面不溶解物，向其中加入试样及与该带3特异结合并标记过的抗带3抗体后，则试样中的带3由固相化CA和标记的抗带3抗体成为夹层，通过存在于试样中的带3，可以测定试样中的血液存在或其量。上述的方法中，如下所述，也可以预先向试样中添加抗带3。即，上述体系中，试样带3上的肽部分通过添加抗带3抗体被识别，另外通过固相化CA用其它方法识别、捕捉带3的糖链部分，进而通过标记抗带3抗体，可以识别与添加的抗带3抗体最初识别的带3的肽部分不同处的肽部分，由抗带3抗体和固相化CA、标记的抗带3抗体所确定的试样中的带3高度地被限定，与夹杂在试样中的多种类糖蛋白难于交叉，所以提高了灵敏度和特异性。另外，本专利技术方法中，除了上述例子外，替换固相化成分和标记成分也可以将固相化抗带3抗体和标记CA组合、或固相化成分和标记成分与CA之间组合，作为特异的检测系都是可以的。在这种情况下，为提高灵敏度和特异性，可以采取与上述类似的方法。作为本专利技术的其他方案可以举出所谓竞争反应检测方法，即试样中的带3捕捉在固相上的同时，将预先准备的并标记过的带3向固相进行竞争的捕捉，利用后者带3的标记可以知道试样中血液存在或其量。作为上述CA和抗带3抗体的标记方法可以使用放射性同位素标记、酶标记、荧光标记、化学发光物质标记等的任何一种方法、例如生物素标记后，用标记后的卵白素检测方法、不直接标记CA、抗带3抗体，对于这些使用标记第二抗体的方法，重要的是只要能检测出标记，对于特异的检测系统都没有任何影响。本专利技术中，也可以将抗带3抗体或CA预先存在于试样中，例如采用在采便杆的表面上预先涂上所需要的可以溶出的抗带3抗体或CA的方法。另外，从含有抗带3粪便等的试样中可以溶解洗脱出抗带3的基液有各种缓冲液如醋酸缓冲液、磷酸缓冲液、TRIS盐酸缓冲液、甘氨酸缓冲液、铵缓冲液、硼酸酸缓冲液、碳酸缓冲液等。这些基液的pH值是4-11.5，优选的是4.5-8.5。这些基液中最好添加接近生理食盐浓度的食盐，另外作为抗菌剂最好添加0.05-0.5重量％的叠氮化钠等。进而作为抗体等，蛋白的稳定剂最好添加0.05-2.0重量％的牛血清白蛋白等。本专利技术因为是检测含在人体红血球膜中带3的方法，所以溶解红血球膜后进行检测更为有效，作为溶解剂可以使用表面活性剂。作为这些溶解剂，适宜的表面活性剂代表例可以举出如下，当然也不仅限于这些。十二烷基苯磺酸钠聚氧化乙烯-异辛基苯基醚(Triton X-100等) 聚氧化乙烯壬基苯基醚(Noident P-40等)聚氧化乙烯山梨糖醇醚(Tween20等)3--1-丙磺酸盐3--2-羟基-1-丙磺酸盐正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷辛酰-N-甲基葡糖酰胺壬酰-N-甲基葡糖酰胺癸酰-N-甲基葡糖酰胺正庚基-β-D-硫代葡糖酰胺正辛基-β-D-硫代葡糖酰胺N，N，-双(3-D-葡糖酰胺丙基)脱氧胆酰胺对于这些表面活性剂的添加方法虽然没有特殊的限制，但是使用上述的缓冲液作为基液时，表面活性剂添加浓度在1重量％以下时更能发挥效果。本专利技术是使用CA和抗带3抗体，通过带3从粪便等试样中检测出含有的人体血液成分的检测方法，特别适用于便潜血的检测方法。如以后实施例所述，这种方法与以往的使用抗血红蛋白抗体的便潜血的检测相比，可以高灵敏度、稳定地检测出便潜血。以下通过实施例具体地说明本专利技术，但是本专利技术不受这些实施例的限制。实施例1使用酶标记抗带3抗体和CA，检测粪便中带3的检测方法(1)带3的离析精制将添加抗凝固剂的人的O型血液200ml，用320Xg离心10分钟，分离血浆。将沉渣悬浮在含有1mM EDTA及5mM 2-巯基乙醇、0.03mM苯甲磺酰氟的200ml的0.05mM磷酸缓冲液(pH7.3)中，用1mM NaOH调节成pH7.5后，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：富山哲雄，成田雅，小番健志，成田重雄，
申请(专利权)人：爱诗爱诗制药株式会社，
类型：发明
国别省市：