被分析物的检测方法技术

本发明专利技术涉及检测唾液样品中被分析物的方法，该方法克服了已知的唾液试验方法存在的问题。所述方法涉及包含棕榈酸和／或硬脂酸的聚氧乙烯山梨糖醇酐衍生物的表面活性剂溶液的使用，对检测特别易于给出假性阳性结果的新鲜唾液样品非常有用。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及检测被分析物(特别是特异性结合分子，例如唾液样品中的抗体或抗原)的方法，本专利技术尤其涉及在未经贮存或冷冻的新鲜唾液样品中的分析物的检测方法。唾液中抗体的检测是诊断各种疾病和病态(特别是肠道感染)的一种方便的方法。哺乳动物(特别是人)中的肠道感染刺激分泌粘液的免疫反应，例如通过激活普通粘膜免疫系统分泌唾液。这一反应开始时常常与血清中的抗体反应平行，一般以存在IgA抗体为特征。然而，在抗原(如细菌或病毒)从机体消除后，分泌粘液(包括唾液)的免疫反应迅速减弱。因此，唾液中抗体的存在反映出当时的，即同时发生的感染。在微生物感染的情况下，例如，唾液中的抗体(此后称作分泌抗体)反映出例如肠道中微生物定居的当时的状态，因此是同时发生感染有用的监视物。另一方面，在微生物从机体消除后，血清抗体持续一段时间。因此，阳性血清抗体试验反映出过去和当时抗原的出现，对临床医生较少有帮助。阳性分泌抗体试验指示出当前或同时发生的微生物感染。由病人提供唾液样品比提供其它液体样品(特别是血清样品)要好得多。而且，在获得唾液样品的过程中，对病人或医生感染的危险性都非常低，因为它不需要使用取血清样品时所需的针头。从唾液样品诊断的方法是公知的。具体地说，AU-A-9067676涉及检测对粘液分泌物(例如唾液)中Helicobacter pylori抗原有特异性的IgG，从而提供了一种监测该微生物在哺乳动物中的当前(即同时)感染的方法。相应的学术出版物是Witt et al.Fron-tiers in Mucosal Immunology 1 693-696(1991)。WO-A-9322682涉及有关H.pylori的基于唾液的试验，其中检测针对H.pylori的IgG抗体。目前可用的基于唾液试验的方法的一个缺点是，在某些情况下，它们可能是不可靠的。试验中获得的假性阳性数量可以高得不可接受。在试图开发有关针对H.pylori的唾液抗体的免疫测定方法而进行的实验中，要求78个受试者将唾液收集到干净的无菌容器中。当试验样品中H.pylori抗体的存在时，由于大量假性阳性结果，发现其与血清试验的结果不能很好地吻合。与其它大多数类型的诊断试验一样，基于唾液的试验的另一个缺点是，为了获得结果，必须将样品依所要分析的顺序送入实验室。这一过程可能花去几天时间，部分抵销了能够获得微生物当前感染指示的优点。此外，病人可能忘记去获取试验结果，特别是在提交样品和取得试验结果之间症状消失时。因此，在几分钟内提供可靠结果的检测唾液样品中被分析物的试验试剂盒将是很有价值的，因为在一般医疗工作者的诊断期间可以进行试验。这将有另一个优点，那就是保证病人取得结果，必要时开处方治疗。然而，当在收集的几分钟内分析唾液样品时，任何基于唾液的试验所存在的假性阳性结果的问题更加严重，过去，假性阳性结果多得使对新鲜唾液样品进行试验获得的结果几乎完全没有意义。人们相信，尤其在新鲜唾液样品中可以出现不足的可靠性，这是由于在样品中存在非特异性结合试验试剂并由此给出假性阳性结果的试剂。当然，向样品中加入降低非特异性结合的试剂是可能的，但也证明存在问题，因为许多这类试剂也降低特异性结合，使得真正的阳性结果与假性阳性一同消失。本专利技术使解决这一问题，并且在保留真正的阳性结果的同时消除假性阳性结果成为可能。本专利技术的第一方面提供了检测唾液样品中被分析物存在的方法，该方法包括使唾液样品与能够和被分析物形成特异性结合复合物的特异性结合剂接触，并且检测特异性结合复合物的存在；其特征在于，首先将唾液样品与包含棕榈酸和/或硬脂酸的聚氧乙烯山梨糖醇酐衍生物的溶液接触。本专利技术方法的优点是可以用非侵入性方法快速并可靠地获得试验结果，此外，它克服了当使用新鲜唾液时出现的问题，能够从“点滴”试验获得可靠的结果。在本专利技术的内容中，“新鲜唾液”指已贮存的时间不长于30分钟，优选地不长于10分钟，常常是短于上述时间的唾液。有必要非常仔细地选择表面活性剂，本专利技术一个惊人的特征是，在大范围的可获得的表面活性剂中，能使我们获得可靠结果的仅有的一些是以上限定的那些。合适的表面活性剂可以按以下商标获得Tween 40、Tween 60、Tween 61、Tween 65和Tween 80。含有40％-65％硬脂酸衍生物的表面活性剂是优选的，包含约55％硬脂酸衍生物及剩余量为棕榈酸衍生物的Tween60是特别优选的，它明显能给出比大多数其它表面活性剂更可靠的结果。当使用以下讨论的固体基质时，最好选择表面活性剂存在的量，以使样品通过基质的流量最大。当表面活性剂以0.1％到1％体积(典型地约0.5％体积)的量存在时，所述流量通常最大。这种量的表面活性剂给出消除非特异性结合而不明显影响特异性结合的最好的结果和可由本专利技术的方法获得的检测极限值。当溶液缓冲到pH约6.8到约7.8，获得最好的结果，但发现溶液缓冲到7.4时最佳。只要导致溶液的pH值保持在优选的范围内，任何缓冲溶液都可以使用。磷酸盐是用于本专利技术特别优选的缓冲液，但可以用来保证溶液的pH值在优选范围内的缓冲液的其它例子是本领域技术人员熟知的。尽管钠盐通常给出最好的结果，但任何水溶性盐(例如钠盐、钾盐或铵盐)均可用于制备所述的缓冲溶液。已发现使用0.001-0.05M，最好是0.02M的磷酸钠溶液可以获得有效的缓冲。其它试剂可以存在在溶液中，以便降低试验样品中的粘蛋白和颗粒物质对试验试剂的非特异性结合，这些试剂包括无机盐如氯化钠和蛋白质和牛血清白蛋白(BSA)。氯化钠可以以约0.1到0.2M的浓度存在。不超过0.2M的浓度上限是非常好的，因为这样有助于特异性结合。典型地，存在于溶液中的氯化钠的浓度是约0.125M。如果存在BSA，则典型地含有约0.05到0.5％(重量)，优选0.1％(重量)的量。所述的被分析物可以是能够与特异性结合剂反应形成特异性结合复合物的任何特异性结合分子。特异性结合复合物的例子包括抗原——抗体复合物，因此，被分析物可以是抗体或抗原。在被分析物是抗体的情况下，它可以是任何同种型的，并且可以是针对任何病原体的抗体。唾液样品分析在由病原体(例如Heli-cObacter pylori，以前称作Camplobacter pylori)引起的肠道感染的诊断中特别有用。如以上的讨论，H.pylori感染由唾液中存在IgG指示，因此，如果试验的目标是检测H.pylori感染，则被分析物可以是对H.pylori抗原有特异性的IgG。术语“抗原”以其最广泛的含义被使用，包括完整的病原体细胞，或来源于病原体的同质的、近同质的或异质的抽提物，所有这些都能结合到唾液中的特异性抗体上。当特异性结合剂是抗原时，它可以是蛋白质、多糖或脂质或它们的任何组合。优选的是抗原的特异性结合剂包括用例如超声波、压力分解、去污剂抽提或分级分离制备的病原体蛋白质、脂多糖或细胞提取物。当本专利技术的方法用于检测H.pylori感染时，特异性结合剂可以是得自H.pylori的抗原。适于在本专利技术的方法中用作特异性结合剂的得自H.pylori的抗原在WO-A9322682中公开。然而，任何H.pylori来源的抗原都可以用作特异性结合剂。方便的和优选的是将特异性结合剂结合到固体支持物上。合适的固本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测唾液样品中被分析物存在的方法，该方法包括使所说的唾液样品与能和被分析物形成特异性结合复合物的特异性结合剂接触，并且检测特异性结合复合物的存在，其特征在于，首先使唾液样品与包含棕榈酸和／或硬脂酸的聚氧乙烯山梨糖醇酐衍生物的溶液接触。２．如权利要求１要求的方法，其中的唾液样品包括新鲜唾液。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：PR古德温，CJ史密斯，
申请(专利权)人：科特克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]