tagA基因以及检测消化性溃疡和胃癌易感性的方法技术

本发明专利技术提供一种分离的核酸，该核酸编码幽门螺旋杆菌大约１２０－１２８千道尔顿抗原或其抗原的片段。其中该抗原与消化性溃疡有关。本发明专利技术也提供在被实验者中检测具１２０－１２８千道尔顿抗原幽门螺旋杆菌菌株存在的方法，其中包括用可检出量ＴａｇＡ抗原或本发明专利技术中的抗原多肽接触从被实验者中取出的含抗体样品的步骤和检测抗原或片段和抗体的结合。表达ＴａｇＡ抗原菌株的检测是消化性溃疡和胃癌的易感性的指示。同时提供不表达有功能ＴａｇＡ抗原的突变幽门螺旋杆菌。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
幽门螺旋杆菌现在之所以被认为是一种重要的人类病原是因为它引起的慢性胃炎是消化性溃疡疾病发作的一种危险因素。同时越来越多的证据表明幽门螺旋杆菌持续感染是胃腺癌发作的危险因子(1，2)，尤其是端胃(3-5)。证据主要来自流行病研究(6-9)，包括成套的病例对照(nested case-control)研究(4，5，10)，而且分子和病理研究支持其生物学合理性(11)。然而，尽管基本上所有的感染者发生胃炎，但是临床幽门螺旋杆菌感染的这一结果只见于少数人中。而且，虽然幽门螺旋杆菌感染普遍见于胃癌病人，但大多数幽门螺旋杆菌感染者从来没有发展为这些肿瘤(12)。于是，鉴别其它能更精确确定幽门螺旋杆菌感染者危险的因素是相当重要的。幽门螺旋杆菌菌株在遗传水平上高度多样，但大多数表型特征是高度保守的。而且，个体可被不止一种菌株感染(4，15)。于是，分离可能影响胃癌发作危险率的幽门螺旋杆菌菌株具体特征是很重要的。最近识别出表型均一性的两个例外。首先，大约50％-60％幽门螺旋杆菌菌株在体外产生液泡化的细胞毒素(20，39)，而且，毒素的产生与消化性溃疡有关(40)。第二，是否在还原性十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)上产生迁移在约120-128千道尔顿(KDa)间的抗原蛋白存在异质性(20)。最近对这种蛋白(可互换的称为TagA或CagA)的测量表明其分子量高达140KDa(23，41)。尽管毒性由一种87KDa蛋白介导，但毒素自己的产生与抗原120-128KDa蛋白的存在相关(20)。以前的研究已经发现约60-80％幽门螺旋杆菌分离物表达120-128KDa蛋白(20，42)。值得注意的是，血清或粘膜分泌物中抗120-128KDa蛋白的抗体的存在与消化性溃疡的存在相关(18，20)。直到现在，关于毒素产生、溃疡或胃癌的关系知道得很少。这是因为以前首次看到120-128KDa抗原后不能进一步描述其特征。以前的研究中，用western印迹观察120-128KDa抗原，但实际上没有显示其它的特征(20)。与western印迹观察抗原的便捷相反，其它的方法如银染(Cover等，1990(20)中图2)不能如此便捷的显示120-128KDa带。该现象解释为抗原与幽门螺旋杆菌其它蛋白相比只以少量存在。最近，Gerstenecker等(43)已报导在幽门螺旋杆菌分离出大约120KDa蛋白，后者与阳性人对照血清反应。但是，实际上还没有进行该抗原的特征(如N-末端序列分析)分析。尽管纯化困难，本专利技术仍然提供了基因的克隆和序列并推定的编码120-128KDa蛋白的氨基酸序列。该数据由无需纯化120-128KDa抗原的方法获取。本专利技术同时提供诊断、治疗和预防的组合物和方法。免疫印迹研究提示tagA+菌株感染者比那些分离出tagA-的病人具更高的胃炎和上皮细胞损伤程度(18)。感染tagA+幽门螺旋杆菌菌株的病人与未感染者和感染tagA-菌株的病人相比胃活组织检查中IL-1α，IL-1β和IL-8表达加强(19)。发炎和上皮损伤所程度可能参与了胃癌的发病机理(1)。于是，在此意义上研究表达tagA幽门螺旋杆菌菌株的重要性成为必需。本专利技术提供一种基于tagA重组片段的新的血清测定方法和测定胃癌易感性的方法，从而满足这些要求。专利技术概述本专利技术提供一种分离的核酸，该核酸编码幽门螺旋杆菌大约120-128千道尔顿抗原或其抗原的片段。其中抗原与消化性溃疡有关。本专利技术也提供在被实验者中检测120-128千道尔顿抗原幽门螺旋杆菌菌株存在的方法，其中包括用可检出量tagA抗原或本专利技术中的抗原多肽接触从被实验者中取出的含抗体样品和检测抗体和片段的反应的步骤。附图简述附图说明图1显示质粒pMC1、pMC2和pMC3的物理图谱。pMC3下的大箭头表示tagA基因的定位和由缺失突变和免疫印迹测定的转录方向。小箭头表示外切核酸酶III衍生片段序列分析的DNA的链和长度。限制性内切酶切位点B，BglII；Ba，BamHI；E，EcoRI；H，HindIII；N，NdeIS，SacI。图2表明用于幽门螺旋杆菌突变子的构建中的pMc3Km的限制图谱。自pILL600的Km盒与pMC的NdeI位点连接产生pMC3Km。箭头指示包含截短的2577bp tagA开放阅读框的开放阅读框。限制性位点是E，EcoRI；B，bglII；H，HindIII；Ba，BamHI；N，NdeI；S，SaI；Sm，SmaI。pMC4表示2.9Kb的pCM3 EcoRI到SacI片段。图3表示质粒pMC3，pYB2，pUT2的物理图谱。pUT2下的大箭头指示tagA基因的定位和由缺失突变和免疫印迹测定的转录方向。限制性内切酶切位点B，BglII；Ba，BamHI；E，EcoRI；EV，EcoRV；H，HindIII；N，NdeIS，SacIX，XbaI。图4表示tagA中DNA片段的物理图谱，这些片段用于形成交迭的基因融合。箭头指示转录的方向。已指示出每一产物的大小。清楚的盒状区域表明这些基因具重复的核酸区域并且已测定用于表达该蛋白的免疫原性表位。专利技术详述核酸本专利技术提供一种分离的核酸，该核酸编码幽门螺旋杆菌大约120-128KDa抗原(TagA)的片段，该抗原与消化性溃疡有关。“分离”是指把它与其它用于临床诊断或科学研究自然有机体的核酸、蛋白质、或其它细胞成分彻底分开。编码120-128千道尔顿抗原的该核酸可以是tagA基因本身，它对表达120-128千道尔顿抗原的幽门螺旋杆菌菌株系是特异的。“特异”是指分离的序列与不表达该抗原的幽门螺旋杆菌菌株的核酸的杂交强度不会显著地高于背景。这类分离核酸的一个实例是一个3543碱基对的开放阅读框，它含有4821碱基对插入片段(SEQ ID NO3)的1072位至4614位核苷酸的部分。含全长tagA基因质粒的细胞系以ATCC登记号69273保藏于美国典型培养物保藏中心(1230 Parklawn Drive，Rockville MD 20852)。这种分离的幽门螺旋杆菌特异的核酸可用如聚合酶链式反应、连接酶链式反应和下文要进一步描述的杂交方法检测表达120-128KDa抗原的幽门螺旋杆菌。核酸或由此衍生的片段可位于一个合适的表达载体和宿主中，而且被用于产生在此要描述的全长的TagA蛋白。编码120-128KDa抗原的抗原片段的核酸的实例是一个截短的2577碱基对的开放阅读框，后者包含3648碱基对插入片段(SEQ IDNO1)1072位到3648位核苷酸的部分。这一特异的核酸可用于以聚合酶链式反应、连接酶链式反应和杂交方法测定具120-128KDa抗原的幽门螺旋杆菌。作为一个代替的方法，3648碱基对序列可在一个合适宿主的载体中而且可用于产生TagA的抗原片段。编码120-128KDa抗原的抗原片段的核酸的另一个实施例是包含SEQ ID Nos1和4(实施例4)的1921位到3648位核苷酸的tagA基因的重组片段(orv220)。这种特异的核酸可用于以聚合酶链式反应、连接酶链式反应和杂交方法测定具120-128KDa抗原的幽门螺旋杆菌菌株。作为一个代替的方法，3648碱基对序列可在一个合适宿主的载体中而且可用于产生T本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的核酸，它编码幽门螺旋杆菌约１２０－１２８千道尔顿抗原或其抗原片段，其中该抗原与消化性溃疡有关。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：TL卡弗，MJ布拉沙，H克莱恩图斯，MKR蒂穆鲁，
申请(专利权)人：范德比尔特大学，奥拉瓦克斯有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]