一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用，所述外周血circRNA标志物为hsa‑circ‑0003638与hsa‑circ‑0058493的组合。与肺纤维化相关的外周血circRNA标志物可用于制备肺纤维化辅助诊断试剂盒。本发明专利技术通过研究外周血circRNA在辅助矽肺和IPF相关肺纤维化诊断的应用前景，阐述差异表达的circRNA对肺纤维化发生的影响，揭示其筛查和诊断价值。因此，本发明专利技术获得了肺纤维化辅助诊断相关外周血circRNAs表达数据和标志物；通过外周血circRNAs生物标志物和辅助诊断试剂盒的研制和应用，可使得鉴定肺纤维化高风险个体变得可行，对预防和控制矽肺和IPF的发生发展具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用
本专利技术属于医学及分子生物学领域，具体涉及一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用。
技术介绍
肺纤维化是以成纤维细胞增殖以及大量细胞外间质聚集并伴有炎症损伤、组织结构破坏为特征的肺部疾病的终末期改变。值得注意的是，肺纤维化并不是一种独立的疾病，而是由物理、化学因素或其他致病因素导致肺间质结构被破坏后引起的肺部组织异常修复。绝大多数的肺纤维化病人病因未明，因此这组疾病也被称为特发性间质性肺炎(IdiopathicInterstitialPneumonia，IIP)，其中特发性肺纤维化(IdiopathicPulmonaryFibrosis，IPF)是IIP最常见的疾病类型。而病因可查的肺纤维化被称为继发性肺纤维化，常见病因有：职业性粉尘吸入相关，如矽肺等；吸入过敏原相关，如过敏性肺炎等。矽肺病是一种常见的职业性肺病，主要特征是肺部弥漫性纤维化。根据《2017年全球疾病负担研究》，从1990年到2017年，因矽肺病所致的伤残损失健康生命年增长了45.4％，矽肺病病例数在二十年间也增长了58.25％。显而易见，矽肺病已经给人类的个体健康带来沉重负担，是我国严重的公共卫生问题之一。矽肺病的病因较为明确，是由于长期暴露于游离二氧化硅粉尘所引起的，但是其发病机制尚不明确。更严重的是，矽肺是一种进行性疾病，即使停止接触游离二氧化硅粉尘，肺部所受到的纤维化损害仍会继续发展，由此可见，矽肺纤维化是一种不可逆的且无法治愈的疾病。r>IPF是一种慢性、进行性的、可致命的疾病，以肺内瘢痕组织形成、进行性呼吸困难和患者诊断后寿命显著缩短为典型特征，多发于老年人群。研究显示，全球有数百万人遭受IPF的影响。一项回顾性研究分析了21个国家的IPF患病率，发现世界各国的IPF患病率呈现上升趋势，而且随着人口老龄化和聚集性空气污染的增加，使得IPF的患病率进一步提升。我国IPF发病率在过去的二十年里也呈现逐步增长的趋势。由于IPF早期症状不明显，人们对于IPF的认知度低，使得患者确诊时间晚，确诊后中位生存期仅2-3年，五年生存率低于30％。因此，早期诊断或筛查对于预防和治疗IPF至关重要。值得一提的是，无论是IPF还是矽肺，其肺部纤维化发生发展的调控机制尚不明确，病人一经确诊，肺部纤维化病变仍会持续进展，且无特效药物能够延缓或逆转肺部纤维化进程。因此，明确肺纤维化的发病机制，并探寻生物标志物作为干预肺纤维化进程的靶点，对控制肺纤维化进展、提高患者生活质量及延长生存时间具有重要公共卫生意义和临床应用价值。非编码RNA广泛存在于外周血中，具有含量丰富、性质稳定、易于实时精确定量检测等特质，更重要的是基于外周血的检测具有侵入性更小、更易获得的优势，因此十分具有临床标志物应用价值。环状RNA(circularRNA，circRNA)是一类重要的非编码RNA，同时由于circRNA具有闭合环状结构，核酸酶对circRNA并不起作用，这使得circRNA在细胞内具有很好的稳定性，被认为是比传统的微小RNA(microRNA，miRNA)等线性RNA更好的生物标记。进一步的实验证据表明，circRNA广泛参与多种纤维化疾病发生发展的调控，包括肾纤维化、心肌纤维化等。综上所述，结合其稳定的结构，circRNA被认定可能是纤维化疾病诊断和预后的新型理想生物标志物。然而，目前关于circRNA参与调控肺纤维化疾病(如：矽肺和IPF)发生发展的研究相对较少，并且这些研究均是基于微观的分子生物学层面探讨circRNA参与肺部纤维化发生发展的机理机制，尚未结合宏观的人群层面综合探讨circRNA对肺纤维化发生发展的影响。与此同时，目前多数研究是基于候选circRNA的策略来探索circRNA与肺纤维化发生发展之间的关联，与全转录组测序相比，所得结果的全面性和精确性存在很大缺陷。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物及其应用，通过研究外周血circRNA在辅助矽肺和IPF相关肺纤维化诊断的应用前景，阐述差异表达的circRNA对肺纤维化发生的影响，揭示其筛查和诊断价值；通过外周血circRNAs生物标志物和诊断试剂盒的研制和应用，可使得鉴定肺纤维化高风险个体变得可行，对预防和控制矽肺和IPF的发生发展具有重要意义。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物，所述外周血circRNA标志物为hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493的组合。其中，所述外周血circRNA标志物的引物为：hsa-circ-0003638的上游引物为：GGTCCTCATAAACAGGTTT，下游引物为：AGAACACGTTGCTGTTCAC；hsa-circ-0058493的上游引物为：CATTTATTCTCACCAGGGTTC，下游引物为：GTTGCATGGCCAGATATCAG。本专利技术还提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的应用，用于制备肺纤维化辅助诊断试剂盒。其中，所述试剂盒用于检测外周血中的hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493。其中，所述试剂盒内包含外周血circRNA标志物的引物：hsa-circ-0003638的上游引物为：GGTCCTCATAAACAGGTTT，下游引物为：AGAACACGTTGCTGTTCAC；hsa-circ-0058493的上游引物为：CATTTATTCTCACCAGGGTTC，下游引物为：GTTGCATGGCCAGATATCAG。其中，所述试剂盒内还包含逆转录、PCR反应用的酶和试剂，如：随机引物、逆转录酶、缓冲液、无酶水、2×SYBRGreenPCRMasterMix和双蒸水，以及内参(18s)。进一步，所述试剂盒内还包含标准品和对照品的一种或两种。本专利技术还提供一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的筛选方法，包括如下步骤：(1)RNA-seq测序方法确定矽肺病例和健康接尘对照中有表达差异的circRNAs：在RNA-seq初筛中，根据circRNA在病例对照之间显著差异表达倍数>1.5且差异有统计学意义P<0.05的情况，确定与矽肺发生可能相关的circRNAs；(2)第一阶段验证：将初筛中确定的显著差异表达circRNAs数据集，与人血清circRNA数据集进行对比筛选，将两数据集中均存在的circRNAs纳入第二阶段验证；(3)第二阶段验证：通过GSE102660数据集下载IPF病例和对照之间circRNAs的表达数据，并利用LimmaR包进行表达差异分析，计算差异表达倍数和P值；(4)将第二阶段验证所获的显著差异表达的circRNAs与第一阶段验证所获的候选circRNAs进行对比，进一步筛选出两数据集本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物，其特征在于，所述外周血circRNA标志物为hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493的组合。/n

【技术特征摘要】
1.一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物，其特征在于，所述外周血circRNA标志物为hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493的组合。


2.根据权利要求1所述的与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物，其特征在于，所述外周血circRNA标志物的引物为：
hsa-circ-0003638的上游引物为：GGTCCTCATAAACAGGTTT，下游引物为：AGAACACGTTGCTGTTCAC；
hsa-circ-0058493的上游引物为：CATTTATTCTCACCAGGGTTC，下游引物为：GTTGCATGGCCAGATATCAG。


3.一种如权利要求1或2所述的与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的应用，其特征在于，用于制备肺纤维化辅助诊断试剂盒。


4.根据权利要求3所述的与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测外周血中的hsa-circ-0003638与hsa-circ-0058493。


5.根据权利要求3或4所述的与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的应用，其特征在于，所述试剂盒内包含外周血circRNA标志物的引物：
hsa-circ-0003638的上游引物为：GGTCCTCATAAACAGGTTT，下游引物为：AGAACACGTTGCTGTTCAC；
hsa-circ-0058493的上游引物为：CATTTATTCTCACCAGGGTTC，下游引物为：GTTGCATGGCCAGATATCAG。


6.根据权利要求5所述的与肺纤维化诊断相关的外周血circRNA标志物的应用，其特征在于，所述试剂盒内还包含逆转录、PCR反应用的酶和试剂。


7.根据权利要求6所述的与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的应用，其特征在于，所述试剂盒内还包含内参。


8.一种与肺纤维化辅助诊断相关的外周血circRNA标志物的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)RNA-seq测序方法确定矽肺病例和健康接尘对照中有表达差异的circRNAs：在RNA-seq初筛中，根据circRNA在病例对照之间显著差异表达倍数>1.5且差异有统计学意义P<0.05的情况，确定与矽肺发生可能相关的circRNAs；
(2)第一阶段验证：将初筛中确定的显著差异表达circRNAs数据集，与人血清circRNA数据集进行对比筛选，将两数据集中均存在的circRNAs纳入第二阶段验证；
(3)第二阶段验证：通过GSE102660数据集下载IPF病例和对照之间circRNAs的表达数据，并利用LimmaR包进行表达差异分析，计算差异表达倍数和P值；
(4)将第二阶段验证所获的显著差异表达的circRNAs与第一阶段验证所获的候选c...

【专利技术属性】
技术研发人员：褚敏捷，张颖轶，程周楠，刘逸辰，朱小琪，郁宇晖，田甜，庄勋，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32