含苯硼酸修饰的高分子材料及其在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用制造技术

本发明专利技术提供一种含苯硼酸修饰的高分子材料在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用，所述含苯硼酸修饰的高分子材料由阳离子聚合物和含苯硼酸的功能基团组成，所述含苯硼酸功能基团共价连接在阳离子聚合物上；所述阳离子高分子包括聚酰胺‑胺树形高分子、聚丙烯亚胺、聚赖氨酸等；所述含苯硼酸修饰的高分子材料可以作为基因编辑核糖核蛋白复合物的胞内递送载体，即将基因编辑核糖核蛋白复合物由细胞外递送到细胞内的载体。本发明专利技术提供的含苯硼酸修饰的高分子材料作为基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送载体的方法可以达到高效率，在同一细胞不同基因位点以及不同种类细胞均有较好的基因编辑效果，并且可以保持核糖核蛋白复合物的生物活性，同时对细胞产生的毒性小，具有良好的生物相容性。

【技术实现步骤摘要】
含苯硼酸修饰的高分子材料及其在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用
本专利技术涉及生物技术、高分子化学、细胞生物学等领域，具体涉及一种新的含苯硼酸修饰的高分子材料及其在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中的应用。
技术介绍
成簇的规律间隔的短回文重复序列(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeatssequences,CRISPR)系统源于细菌和古细菌的自适应性免疫系统，其主要用来抵御来自于噬菌体、质粒等外源性核酸的入侵。而利用这种天然存在的免疫系统，CRISPR/Cas系统已经被开发成为一种新型的基因编辑技术，它能够定点靶向基因组的目标序列或者同时靶向基因组多个目标序列用于基因组编辑。该系统目前已经被广泛应用于基因相关疾病的治疗，定向检测基因组区域的活体成像，疾病相关新靶点的鉴定，基因功能的识别以及动物疾病模型建立等多方面的研究。在众多CRISPR/Cas系统中，CRISPR/Cas9作为最具有代表性的基因编辑系统，主要包含两个核心组分：CRISPR/Cas9核酸内切酶及单联导向RNA(singleguidedRNA,sgRNA)，自2013年以CRISPR/Cas9为基础的基因编辑技术被成功应用于哺乳细胞基因组编辑，该技术已经应用一系列难治愈的疾病上，包括恶性肿瘤、镰刀形细胞贫血症、I-H型粘多糖病、阿尔兹海默症、肝糖原贮积症、血友病、囊性纤维化、杜式肌肉营养不良症及其他疾病。在基于CRISPR/Cas9系统的基因组编辑技术被应用于临床之前，除了需要提高基因编辑的特异性，降低脱靶和基因组突变率等复杂的技术挑战外。另一方面，如何安全有效地将CRISPR/Cas9基因编辑系统导入到特定的细胞、组织或者器官中以获得期望的治疗效果是另一个需要解决的关键性问题。但是由于目前能够高效安全递送CRISPR/Cas9的载体系统的匮乏，导致了CRISPR/Cas9基因编辑技术在临床应用上的潜力受到极大的限制。因此开发高效低毒的CRISPR/Cas9的递送载体系统，对推动CRISPR/Cas9基因编辑技术向临床应用转化，降低毒副作用，提高治疗的安全性，具有极其重要的科学价值和研究意义。目前在体外或体内使用CRISPR/Cas9系统进行基因组编辑通常有三种方式。第一种方式是将Cas9蛋白和sgRNA编码进同一个pDNA载体中进行基因组编辑。第二种方式是同时递送Cas9mRNA和sgRNA进行基因组编辑。第三种方式是使用Cas9核糖核蛋白复合物和sgRNA形成的复合物进行基因组编辑。这三种递送方案各有优缺点，并且各自面临着独特挑战。在这三种CRSPR-Cas9的递送形式中，最简单有效的方法就是递送Cas9蛋白和sgRNA形成的复合物。与递送基于质粒pDNA的模式相比，递送Cas9蛋白与sgRNA形成的复合物可以避免递送pDNA所引起的插入基因组风险以及转录及翻译的过程。另一方面，由于pDNA长期存在于细胞中，会持续表达Cas9蛋白，从而导致Cas9蛋白长时间存在于细胞中进行基因编辑，这也会导致强烈的免疫应答和更高的脱靶效应。而与递送mRNA的模式相比，Cas9蛋白的递送除了可以避免mRNA的翻译过程，而且还可以免受细胞内的RNA的干扰。然而，由于Cas9蛋白的分子量较大与结构的复杂性，在被细胞摄取后溶酶体逃逸效率比较低，同时在运输和储存的过程中易被降解和失活，因而发展能够递送Cas9核糖核蛋白复合物的纳米载体面临着巨大的挑战。目前报道的用于Cas9蛋白递送的非病毒载体有阳离子聚合物，阳离子脂质体，类脂质衍生物，脂质体复合物，水凝胶纳米粒，金纳米粒，DNA纳米线球，金属有机框架以及超薄二维黑磷纳米片。其中，相比于众多的递送方式，高分子载体具有合成成本低、易进行化学修饰、容易实现内涵体逃逸、生物相容性好等优势，在基因编辑核糖核蛋白复合物胞内递送中具有广阔的应用前景。现有针对核糖核蛋白复合物的递送方法通常需要对核酸内切酶如Cas9进行化学修饰或生物改造，合成成本高，并且可能会破坏蛋白质原有的生物活性，不便于普及和应用。
技术实现思路
为了解决现有技术中高分子载体不能很好地结合核糖核蛋白复合物的问题，本专利技术创新地提供了一类含苯硼酸修饰的高分子材料作为核糖核蛋白复合物胞内递送的载体。这类载体胞内递送效率高，递送到细胞内的复合物仍具有生物活性。同时材料自身及递送操作过程对细胞产生的毒性小。本专利技术提出利用含苯硼酸的阳离子高分子来实现核糖核蛋白复合物的高效递送。本专利技术中，一方面，苯硼酸分子能与核酸内切酶表面的阳离子基团如氨基、咪唑等在中性条件下形成氮-硼配位键；另一方面，高分子上的阳离子基团可以和复合物中的核酸以及蛋白质表面的负电荷区域通过静电相互作用结合，形成稳定的复合物。本专利技术用这一创新构思，设计合成了一类含有苯硼酸分子的阳离子高分子，进而获得高效、低毒的核糖核蛋白复合物递送载体。本专利技术提供了一类含苯硼酸修饰的高分子材料，所述含苯硼酸修饰的高分子材料包括阳离子聚合物和含苯硼酸的功能基团，所述含苯硼酸的功能基团通过共价键连接在阳离子聚合物上。所述含苯硼酸修饰的高分子材料的结构如式(1)～式(3)所示：式(1)-式(3)中，R1为阳离子聚合物，R2为连接键，所述连接键包括-NH-CH2-、-NH-、-NH-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-O-、-NH-C(＝O)-NH-、-NH-C(＝S)-NH-等；R3、R4、R5、R6为化学官能团，分别独立地选自H、卤素、C1-C5烷基、C1-C5甲氧基、硝基等；优选地，R3、R4、R5、R6分别独立地选自H、F、Cl、Br、甲基、甲氧基、硝基；进一步优选地，R3、R4、R5、R6分别独立地选自H。X为含苯硼酸功能基团的连接数，X为1-256之间的整数；优选地，X为42-128之间的整数；进一步优选地，X为42-84之间的整数。其中，R1包括但不局限于如式(4)所示的聚酰胺-胺树形高分子、如式(5)所示的支化聚乙烯亚胺、如式(6)所示的线性聚乙烯亚胺、如式(7)所示的α-聚赖氨酸、如式(8)所示的ε-聚赖氨酸等；式(4)中，n为1-10之间的整数；优选地，n为4-6之间的整数；进一步优选地，n＝5；m为2-4之间的整数；优选地，m＝3或4；进一步优选地，m＝4；M是聚酰胺-胺树形高分子的核心；所述核心为乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1,12-十二烷二胺时，m＝4；所述核心为氨时，m＝3；所述核心为甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、正辛胺、正癸胺、正十二胺时，m＝2；优选地，核心为氨或乙二胺。式(5)中，n为2-100之间的整数。式(6)中，n为20-1500之间的整数。式(7)中，n为20-1000之间的整数。式(8)中，n为20-1000之间的整数。优选地，所述含苯硼酸修饰的高分子材料的结构如式(1)-式(3)所示；所述阳离子聚合物的结构式如式(4)所示，其本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种含苯硼酸修饰的高分子材料，其特征在于，所述含苯硼酸修饰的高分子材料包括阳离子聚合物和含苯硼酸的功能基团，所述含苯硼酸的功能基团通过共价键连接在所述阳离子聚合物上；所述含苯硼酸修饰的高分子材料的结构如以下式(1)～式(3)所示：/n

【技术特征摘要】
1.一种含苯硼酸修饰的高分子材料，其特征在于，所述含苯硼酸修饰的高分子材料包括阳离子聚合物和含苯硼酸的功能基团，所述含苯硼酸的功能基团通过共价键连接在所述阳离子聚合物上；所述含苯硼酸修饰的高分子材料的结构如以下式(1)～式(3)所示：



式(1)-式(3)中，
R1为阳离子聚合物；
R2为连接键；
R3、R4、R5、R6分别为化学官能团，分别独立地选自H、卤素、C1-C5烷基、C1-C5甲氧基、硝基；
X为含苯硼酸功能基团的连接数，为1-256之间的整数。


2.如权利要求1所述的含苯硼酸修饰的高分子材料，其特征在于，所述连接键R2选自-NH-CH2-、-NH-、-NH-C(＝O)-、-NH-C(＝O)-O-、-NH-C(＝O)-NH-或-NH-C(＝S)-NH-。


3.如权利要求1所述的含苯硼酸修饰的高分子材料，其特征在于，所述阳离子聚合物选自：如式(4)所示的聚酰胺-胺树形高分子、如式(5)所示的支化聚乙烯亚胺、如式(6)所示的线性聚乙烯亚胺、如式(7)所示的α-聚赖氨酸或如式(8)所示的ε-聚赖氨酸：



式(4)中，n为1-10之间的整数；m为2-4之间的整数；M是聚酰胺-胺树形高分子的核心；核心为乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1,12-十二烷二胺时，m＝4；核心为氨时，m＝3；核心为甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、正辛胺、正癸胺、正十二胺时，m＝2；



式(5)中，n为2-100之间的整数；



式(6)中，n为20-1500之间的整数；



式(7)中，n为20-1000之间的整数；



式(8)中，n为20-1000之间的整数。


4.如权利要求1所述的含苯硼酸修饰的高分子材料，其特征在于，所述含苯硼酸修饰的高分子材料的结构如式(1)-式(3)所示；所述阳离子聚合物的结构式如式(4)所示，其中，n为1-10之间的整数，m为2-4之间的整数，M为乙二胺、丁二胺、己二胺、辛二胺、癸二胺和1,12-十二烷二胺时，m＝4；核心为氨时，m＝3；核心为甲胺、乙胺、正丙胺、正丁胺、正戊胺、正己胺、正辛胺、正癸胺、正十二胺时，m＝2；连接键R2为-NH-CH2-；R3、R4、R5、R6分别独立地选自H、F、Cl、Br、甲基、甲氧基、硝基；X为1-256之间的整数。


5.如权利要求1所述的含苯硼酸修饰的高分子材料，其特征在于，所述含苯硼酸修饰...

【专利技术属性】
技术研发人员：程义云，平渊，万涛，刘崇懿，吕佳，
申请(专利权)人：华东师范大学，浙江大学，
类型：发明
国别省市：上海;31