用于体外测定红细胞生成素生物活性的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术涉及含有ＥＰＯ样品体内ＥＰＯ活性的体外测定方法。更具体地说，本方法包括在去除脱唾液酸ＥＰＯ的条件下处理含有ＥＰＯ的样品和测定所得处理样品的体外ＥＰＯ活性。在优选的实施方案中，通过将此样品与人肝癌细胞系ＨｅｐＧ２的细胞孵育而将脱唾液酸ＥＰＯ从该样品中去除，并且通过将此处理过的样品与ＥＰＯ反应性细胞系的细胞孵育并测定此ＥＰＯ反应性细胞的增殖或活力以测定体外的ＥＰＯ活性。例如，本发明专利技术对定量多种样品类型中的生物学活性ＥＰＯ是有用的。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

红细胞生成素(EPO)是一种刺激哺乳动物红细胞类前体细胞成熟且因此调节红细胞产生的糖蛋白激素。人EPO(hEPO)的纯化和该EPO基因的克隆导致重组人EPO的商业化生产，其已成功用于对具有由于肾衰竭所致贫血病人的治疗，并且在临床上对治疗其它贫血也是有用的。目前定量样品，例如大量药物制剂中生物活性EPO的方法笨拙、昂贵且耗时。本专利技术提供了测定EPO体内生物活性安全、快速和相对廉价的方法和用于测定EPO生物活性的试剂盒。
技术介绍
EPO是一种刺激红细胞类前体细胞增殖、分化和成熟至成熟红血细胞的糖蛋白激素。EPO已被纯化(Miyake等，(1977)生物化学杂志2525558)并被分子克隆(Lin等，(1985)美国自然科学院院报827580)，并且重组hEPO已成功用于由晚期肾病所致贫血的治疗。在与AIDS、类风湿性关节炎、血癌和早熟有关的贫血的治疗中以及为了增加术前收集自身血液的产量中也已有报导EPO的临床使用。重组hEPO具有30.4KD的分子量，其40％为碳水化合物。对EPO糖基化性质和功能的研究表明hEPO的大部分寡糖链为含有岩藻糖、唾液酸化(sialylated)的四天线型寡糖。人尿中EPO和在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞和人B-淋巴母细胞中制备的重组EPO的糖基化结构类似但不相同。糖基化以乎在EPO溶解性、生物合成和分泌以及EPO的体内代谢中发挥作用。对糖基化在体内的代谢作用且特别是唾液酸的存在已进行了研究。已证实尿液和重组脱唾液酸EPO由于肝脏的快速清除而在体内丧失活性。从这些及类似研究表明唾液酸掩盖了倒数第二位的半乳糖残基且因此保护EPO免受肝脏脱唾液酸糖蛋白(半乳糖基)受体的清除。因此，EPO寡糖末端唾液酸残基的丢失暴露出半乳糖残基，导致脱唾液酸(desialylated)(也称作去唾液酸(asialylated))EPO由于结合至肝脏受体而从血浆中快速清除。虽然脱唾液酸EPO由于其快速消除而在体内基本上无生物活性，但在已建立的体外测定中可维持其生物活性。用于体外测定EPO生物活性的标准测定法包括测定苯肼处理贫血小鼠脾成红血细胞(Krystal(1983)实验血液学.20649)或人多能白血病细胞系(Lewis等.，(1989)实验血液学.17102)对含氚胸苷的掺入、测定59Fe向培养骨髓细胞的掺入(Goldwasser等.(1975)内分泌学97315)以及测定EPO-依赖性细胞系的生长(Kitamura等(1989)血液73375)。因为体外测定不能够区分唾液酸化和脱唾液酸化的EPO，故此测定在定量预期在体内有活性EPO的数量中是没有用的。例如，如果含有EPO的样品也含有显著量的脱唾液酸EPO，那么体外测定将提供该体内活性的过高估计。因此，体内测定用于测定EPO的体内活性。具体地说，通过将59Fe掺入到红细胞增多症小鼠(Cotes等(1961)自然1911065)或饥饿大鼠(Gold wasser等(1975)酶学方法37109)的成红血细胞中测定EPO活性。在当今所用的为Cotes等方法修饰的测定中，将雌性小鼠暴露于低压下14天。内源性红细胞形成受到经暴露至减压所产生红细胞增多症的抑制。由于低氧后红细胞增多症状态继续维持，任何新的红细胞形成可归就于外源性EPO的施用。然后将测试样品和EPO标准品皮下注射至条件小鼠。EPO注射48小时后，测定59Fe。再过48小时后取血样，并定量放射性活性。放射活性的量直接与注射的标准EPO剂量成比例；从标准曲线计算未知样品的体内活性。该体内生物测定被广泛看作是体内生物学活性的唯一真正测定，因为其既测定EPO的循环寿命又测定其增殖活性。然而，该体内测定有明显的缺陷因为其费力、昂贵、耗时且易于有动物至动物变异。本专利技术提供了克服
技术介绍
方法缺陷的体外定量EPO体内活性的方法。专利技术小结本专利技术涉及用于体外测定含有EPO样品的体内EPO活性的方法。更为特别地，本专利技术包括在去除脱唾液酸EPO的条件下处理含有EPO的样品，和体外测定此得到处理样品的EPO活性。在优选的实施方案中，通过将样品与人肝癌细胞系HepG2的细胞孵育而从该样品中去除脱唾液酸EPO，并且通过将该处理过的样品与EPO-反应性细胞系的细胞孵育并测定该EPO-反应性细胞的增殖或存活而体外测定EPO的活性。本专利技术的另一个方面提供包括2个容器的试剂盒，其中第一个容器中含有表达脱唾液酸糖蛋白受体的细胞，且第二个容器含有EPO-反应性细胞。在另一实施方案中，该试剂盒进一步包括第三个容器，其含有活力显示染料，如3--2，5-二苯基溴化四唑鎓(MTT)。专利技术详述本专利技术涉及用于体外测定含有EPO样品的体内EPO活性的方法。更具体地说，本方法包括在去除脱唾液酸EPO的条件下处理含有EPO的样品、和体外测定此得到处理样品的EPO活性。本专利技术在测定欲用于临床用途EPO制剂的体内活性中特别有用。体外EPO活性定义为在体外刺激表达有功能EPO-受体细胞，例如红细胞类前体细胞增殖或存活的能力。如下所述，唾液酸化和脱唾液酸EPO在体外均有活性。体内EPO活性定义为在体内刺激红细胞类前体细胞增殖的能力。在这里，由于快速的肝脏清除，故认为脱唾液酸EPO基本上无体内活性。根据本专利技术，含有EPO的样品可以是颗粒状或液体，并且优选是血清或血浆、细胞培养基、纯化或部分纯化的重组EPO，或欲用于临床用途、稳定性或制剂研究的EPO制剂。根据本专利技术，在去除脱唾液酸EPO的条件下处理含有EPO的样品。EPO的脱唾液酸导致EPO寡糖次末端半乳糖残基的暴露。因此，通过将该样品用对半乳糖具有亲和性的凝集素，例如AbrinA进行亲和层析或通过以对半乳糖特异性的固定抗体的亲和层析可将脱唾液酸EPO从含有EPO的样品中去除。用于进行凝集素亲和层析的方法对普通的技术人员来说是已知的。在另一个实施方案中，通过与表达脱唾液酸糖蛋白受体细胞孵育从含有EPO的样品中去除脱唾液酸EPO。此细胞可天然表达脱唾液酸糖蛋白受体，或可重组加工成表达此受体。例如，以编码脱唾液酸糖蛋白受体HL-1和HL-2亚单位的cDNA转染的成纤维细胞表达有功能的受体。可根据Shia等(1989)方法美国自然科学院院报861158获得表达该重组脱唾液酸糖蛋白受体的转染成纤维细胞。在优选的实施方案中，通过与已知以高浓度天然表达有功能脱唾液酸糖蛋白受体的人肝癌细胞系HepG2(ATCC No.HB 8065)的细胞孵育从含有EPO的样品中去除脱唾液酸EPO(见，例如，Lodish，(1991)生化科学进展16374)。HepG2细胞系由Knowles等(1980)科学209497和Knowles等美国专利4,393,133中所描述。用于孵育含有EPO的样品与表达脱唾液酸糖蛋白受体的细胞的合适条件可由熟练的技术人员加以测定并且可依细胞类型和样品来源而变化。在一个实施方案中，将细胞培养至亚-汇合，洗涤并将细胞悬液加入到组织培养板小孔中。含有附着细胞的每个孔以缓冲液洗几次，去除缓冲液，并将EPO标准品或测试样品加入到每个小孔中。将此细胞与含有EPO的样品于37℃ 5％CO2和95％空气的潮湿环境中孵育过夜(约15-20小时)。来自根据本专利技术称为“处理过的样品”本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于体外测定含有ＥＰＯ样品中体内红细胞生成素（ＥＰＯ）活性的方法，包括在去除脱唾液酸ＥＰＯ的体外条件下处理该样品，并测定此处理过样品的体外ＥＰＯ活性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：PJ利斯，JK格伦，CW苏，
申请(专利权)人：奥索麦克尼尔药品公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]