一维核磁共振用于鉴定靶生物分子配体的用途制造技术

本发明专利技术提供了鉴定与特异性靶分子结合的化合物的方法。该方法包括下列步骤：ａ）得到一种化学化合物或化合物混合物的第一Ｔ↓［２］或扩散过滤质子谱；ｂ）将一种化学化合物或化合物混合物与靶分子接触；ｃ）得到在步骤（ｂ）中已与靶分子接触过的一种化学化合物或化合物混合物的第二Ｔ↓［２］或扩散过滤质子谱；ｄ）比较所述第一和第二Ｔ↓［２］或扩散过滤质子谱以确定所述第一和所述第二谱之间的差异，所述差异表明存在的一种或多种化合物是已与靶分子结合的配体。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及用一维核磁共振(NMR)谱筛选与靶生物分子结合的化合物的方法。
技术介绍
发现新的药物先导物的一种最有效的方法是随机筛选合成化合物和天然产物数据库以发现与特定靶分子结合的化合物(即鉴定该靶的配体)。利用该方法，通过配体与靶分子形成物理结合的能力或者通过其改变靶分子功能的能力来鉴定配体。当寻找物理结合时，通常将靶分子与一种或多种被推测是配体的化合物接触，然后进行检测以确定所述靶分子与一种或多种化合物之间是否形成了复合物。所述检测是本领域熟知的，用于检测标志着复合物形成的靶分子中的总变化(例如，大小、电荷、迁移率的变化)。若测量功能改变，则要确立检测条件以便测量与靶分子有关的生物学或化学事件(如，酶催化的反应、受体介导的酶激活作用)。为了鉴定一种改变，在与待测化合物接触前后确定靶分子的功能。现有的物理和功能检测已经被成功地用于鉴定用于设计治疗化合物的新的药物先导物。但是，这些检测方法本身有缺陷，不能很好地解决精确性、可信度和效率问题。现有检测方法的一个主要缺陷是“假阳性”问题。在典型的功能检测中，“假阳性”是引发检测的化合物，但该化合物在引发所需的生理学反应中不是有效的。在典型的物理检测中，“假阳性”是例如本身与靶以非特异性方式相连(例如非特异性结合)的化合物。在筛选较高浓度的推测配体时，由于许多化合物在所述浓度有非特异性作用，假阳性是特别普遍的，而且引起许多问题。以类似的方式，现有检测方法还受“假阴性”问题的困扰，在检测中，当化合物产生阴性反应，但所述化合物实际上是靶配体时，会出现这一问题。在待测化合物浓度相对于所述化合物与靶的结合或分解常数过高(引起毒性)或过低的检测中，通常发生假阴性。最近已表明，可用二维15N/1H光谱分析鉴定与靶蛋白质结合的化合物，这种方法克服了与用于配体鉴定的其它现有检测方法有关的许多问题。但是，这种方法要求蛋白质是15N标记的、可溶的并在高达0.3mM或更高的浓度仍表现正常。此外，只有可产生可分析的15N/1H相关图谱的蛋白质才能使用这种方法，就目的的技术水平而言，所述方法限于小于40 kDa的靶蛋白质。另外，这种方法费时，即将化合物以10个为一组进行检测，并且当确定了所述混合物中至少有一种化合物有活性时，就必须分别检测每种化合物与靶蛋白质的结合。由于现有筛选方法本身所固有的问题，仍然需要提供新的、快速、有效、精确和可靠的筛选化合物的方法以鉴定和设计与特定靶特异性结合的配体。专利技术综述在一个方面，本专利技术提供了筛选化合物的生物活性以鉴定与特异性靶分子结合的配体的方法。该方法包括下列步骤a)得到一种化学化合物或化合物混合物的第一T2或扩散过滤质子谱；b)将一种化学化合物或化合物的混合物与靶分子接触；c)得到在步骤(b)中已与靶分子接触过的一种化学化合物或化合物混合物的第二T2或扩散过滤质子谱；d)比较所述第一和第二T2或扩散过滤质子谱以确定所述第一和所述第二谱之间的差异，所述差异表明存在的一种或多种化合物是已与靶分子结合的配体。若本专利技术方法在步骤(b)中筛选一种以上化合物，即化合物的混合物，并且，若从所述混合物产生的第一谱与存在靶分子条件下从所述混合物产生的谱之间有差异，如果不存在靶分子条件下的所述活性化合物的谱是已知的，则可立即鉴定该活性化合物。这是由于在步骤(d)中观察到的谱之间的差异发生于所述活性化合物的化学位移处。在不存在所述混合物中所述化合物的已知化学位移资料的条件下或为了确定结合，还可进行其它步骤以鉴定所述混合物中的哪种哪些化合物与靶分子结合。这些其它步骤包括步骤(e)得到混合物中各化合物的T2或扩散过滤质子谱；f)将所述混合物中的每种化合物分别与靶分子接触，g)得到与靶分子接触后的所述混合物中各化合物的T2或扩散过滤质子谱；h)将步骤g)中得到的每种谱与单独用靶分子得到的第一谱进行比较以确定所比较谱之间的差异，通过所述差异鉴定存在的化合物是已与靶分子结合的配体。本专利技术的一项优点是本专利技术方法能够确定潜在配体与任何大小或组成的未标记靶分子结合，只要所述靶比潜在配体足够大以致在与所述靶分子结合后可使松弛率或扩散率发生变化。本专利技术的另一项优点是本专利技术方法能够确定甚至很弱结合的配体与靶分子的结合。本专利技术的其它优点是本专利技术方法能够鉴定化合物混合物中的活性化合物，通过将不同谱中的化学位移与不存在靶生物分子条件下，混合物中所含已知化合物的化学位移直接比较来确定的。在所述优选的实施方案中，可以在存在第二结合配体的条件下，完成确定配体结合的方法。根据所述实施方案，在与待测化合物接触前，将所述靶分子与第二配体结合。该方法使用上述T2或扩散过滤质子谱以鉴定与靶分子结合的前一个和后一个配体。靶分子与两个或多个配体的复合物形成，并优选用NMR光谱或X射线晶体照相术获得结构数据。用所述结构数据确定配体彼此以及与靶分子的空间方向。以空间方向为基础，将配体连接在一起以形成高亲和性配体，所述配体可用作特定靶分子的配体并可用作潜在的药理学活性药物。以有机化学领域熟知的键角原理和键长度资料为基础，通过保持配体彼此间以及配体与靶分子间的空间方向来选择适宜的连接基团。结合至少两个配体以形成高亲和性配体的连接方法或合成方案通过熟知的合成方法和/或反合成分析来完成。通过实际上可产生最终配体并不限于通过连接基团简单连接两个配体的任何方法可制备高亲和性配体。可利用任何线性合成或汇集合成法来形成最终产物。在发现至少两个与靶分子(优选蛋白质)有亲和性的配体后，设计高亲和性配体并用本领域技术人员熟知的方法制备。从具有不同原子和分子排列、立体化学等的多种小分子池中选择配体。限制因素是至少两个配体有一定的亲和性可作为多肽或靶分子上至少一个位点的配体。但是，本文公开的筛选方法可鉴定一种或多种配体，所述配体可通过常规药物设计方法操作以形成药理学活性产物或者可用于本文公开的药物设计方法以便将至少两个配体相连形成高亲和性配体。因此，分子设计方法包括用一维T2或扩散过滤谱鉴定靶分子的第一配体部分；用一维T2或扩散过滤谱鉴定靶分子随后的配体部分；形成所述靶分子的第一和第二配体部分的复合物；获得所述复合物的结构数据，由此确定靶分子上第一和第二配体部分的空间方向；连接第一和第二配体部分以形成是药理学活性药物的高亲和性配体，同时保持配体部分的空间方向。可以从不存在或者存在第一配体的条件下，鉴定第二配体部分(例如，在与待测化合物接触以鉴定第二配体前，可将靶分子与第一配体结合)。在优选的实施方案中，在筛选和设计方法中所用的靶分子是多肽。优选以重组形式生产所述多肽靶，所述多肽靶是用含有编码所述多肽的多核苷酸的表达载体转化的宿主细胞而得到的。附图描述在构成本说明书一部分的附图中附图说明图1表示(A)化合物1的含水缓冲液的T2过滤谱，(B)存在FKBP条件下，化合物1的T2过滤谱，(C)FKBP T2过滤谱，(D)从(B)中减去(C)的差谱，和(E)从(A)中减去(D)的差谱。对于所有试验，T2过滤自旋锁时间是200ms，自旋回波延迟是1ms，化合物1的浓度是100μM，FKBP的浓度是50μM，缓冲液是50mM PO4，100mM NaCl，pH6.5(95％D2O)。图2表示(A)化合物1-9的混合物的T2过滤谱，(B)存本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种筛选化合物以鉴定化合物是与特异性靶分子结合的配体的方法，该方法包括下列步骤： ａ）得到一种化学化合物或化合物混合物的第一一维Ｔ↓［２］或扩散过滤谱；ｂ）将一种化学化学化合物或化合物混合物与靶分子接触；ｃ）得到在步骤（ｂ）中已与靶分子接触过的一种化学化合物或化合物混合物的第二一维Ｔ↓［２］或扩散过滤谱；和ｄ）比较所述第一和第二一维Ｔ↓［２］或扩散过滤谱以确定所述第一和所述第二谱之间的差异，所述差异表明存在的一种或多种化合物是已与靶分子结合的配体。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：SW菲斯克，PJ哈杜克，ET奥莱尼查克，
申请(专利权)人：艾博特公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]