生长激素调节的生长标记制造技术

本发明专利技术公开了其表达受人生长激素调控的一种新基因、组成该基因的ＤＮＡ以及该基因编码的蛋白质。该ＤＮＡ具有序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸序列，该基因编码的蛋白质具有序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２所示的氨基酸序列。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种其表达受人生长激素调控的基因，组成该基因的DNA，该DNA编码的蛋白质，以及使用这些DNA和蛋白质的诊断试剂。人生长激素(hGH)由于其生长的刺激效能，在世界上已广泛用作治疗药物来治疗患生长激素(GH)分泌缺陷、Turner综合征或慢性肾病的儿童。GH具有广泛的生理活性，它调节参与生长、代谢、分化等的许多基因的组织特异性表达。GH对细胞生长或基因表达的一些效应取决于性别，或受垂体的GH分泌方式调控。生长因子(包括GH)结合细胞膜上各自的受体，导致细胞信号转导通道中的STAT(信号转导物和转录激活物)磷酸化，进而将各自信息传输至胞核。然而，GH对细胞核基因的效应还未得到阐述。最近，由于注意到GH分泌不足或过量的患者患有心脏功能紊乱，因此已经开始着手研究GH或胰岛素样生长因子-1(IGF-1)对心脏功能和结构的效应。特别是，已经提出GH或IGF-1参与调控心脏功能的发育。已经证实，心脏功能紊乱可通过使GH或IGF-1水平正常化来部分恢复。同时，从染色体21q22.3克隆出一个新的基因，该基因编码一种富含谷氨酸的蛋白，并且已经证实，该基因只在成年人心脏和骨骼肌中表达。在上述背景下，本专利技术的目的是提供一种新的其表达受人生长激素调控的基因，组成该基因的DNA以及该基因编码的蛋白质。本专利技术者在采用家兔软骨细胞的研究中发现有这样一个基因，该基因的表达受诸如生长激素(GH)的生长因子所调控，其在年老的软骨细胞中的表达水平比年轻细胞中的高，用生长激素处理可使升高的表达水平恢复至在较年轻软骨细胞中所见的表达水平，而且该基因在异常细胞(包括肿瘤细胞)中强烈表达。本专利技术者分离、鉴定并分析了该基因，从而揭示它是一种新基因，它保留了超越种类(如人和家兔)之间共同的氨基酸序列。本专利技术基于这些发现而得以实现。因此，本专利技术提供了一种DNA，它具有序列表中SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种蛋白质，它具有序列表中SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本专利技术还提供了一种蛋白质，该蛋白质在人肿瘤细胞中的表达比在人正常细胞中的表达有所增强，它包括相对于序列表SEQ ID NO2所示氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、替代或增加的氨基酸序列。在这里，人肿瘤细胞的例子包括早幼粒细胞性白血病细胞、慢性粒细胞性白血病细胞、结肠直肠腺癌细胞、肺癌细胞和/或黑色素瘤细胞。本专利技术还提供了上述蛋白质，该蛋白的表达水平随年龄老化而增强，通过生长激素处理恢复至较年轻细胞中所见的表达水平。本专利技术还提供多个DNA，每个DNA具有编码一种上述蛋白质的核苷酸序列。这些序列借助关于遗传密码简并性的常规知识来按需构建。本专利技术还提供了能表达上述DNA之一的质粒。本专利技术还提供了与上述DNA之一特异性杂交的寡核苷酸。这些寡核苷酸可用来提供诊断试剂，其中这些寡核苷酸用作引物、探针或标记。另外，本专利技术还提供了针对上述蛋白之一的多克隆或单克隆抗体。根据采用抗体的免疫试验，这些抗体可用来提供诊断试剂。本专利技术者利用mRNA差别性展示(differential display)和PCR-选择cDNA扣除法(PCR-select cDNA subtraction)来初步检测受生长激素调控的基因，并证实家兔软骨细胞中有其表达受生长激素调控的基因即用mRNA差别性展示，发现在用100ng/mlrhGH处理家兔软骨细胞后1天受刺激产生一条电泳条带(N11)。切下该条带，抽提其DNA，克隆并用常规方法测序。发现该DNA片段的长度为505碱基，该DNA揭示，它与任何已鉴定的基因没有有意义的同源性。然而，发现了同源的人和小鼠EST(表达序列标记)。将该条带的DNA归类为同源簇HCD20，而各自的家兔基因命名为“HCD20(11)”。其它的实验揭示，用于mRNA差别性展示从而导致发现HCD(11)的家兔有一定程度的异常，因为在其它年轻家兔软骨细胞中用生长激素处理，我们没有检测到HCD20(11)基因的表达有任何改变。然而，令人惊奇的是，发现年老的细胞中HCD20(11)基因的表达水平大大提高，而且，GH处理使其恢复至年轻家兔软骨细胞所特有的较低的水平。用已从家兔软骨细胞抽提出的mRNA构建的cDNA文库测定了HCD20(11)基因的全长DNA序列。由于如上所述，对应于该基因的505碱基DNA片段的核苷酸序列显示出与人EST高度同源，因此用该家兔HCD20(11)一特异性DNA片段作为探针来搜寻该基因的人类似物(hGHRGM人生长激素调控的生长标记)。该DNA片段具有序列表SEQ IDNO3所示的核苷酸序列。回收获得携带hGHRGM基因不同区域的9个独立的噬菌体克隆。纯化它们的DNA并重新克隆到pUC18载体中并测序。因此，装配出一个全长765碱基的核苷酸序列。该序列如序列表中SEQ ID NO1所示。序列表的SEQ IDNO2另外示出了推导出的包括93个氨基酸残基的该推定蛋白质的氨基酸序列。预计该蛋白位于细胞核内。预计它具有超越种类的非常高的保守性，因为我们的测定已经揭示其和家兔类似物的氨基酸序列没有不同。这表明蛋白在生命的基本功能中起作用。用BLASTP搜寻法比较hGHRGM蛋白的氨基酸序列与已知多肽的氨基酸序列。人Scr同源性3H结构域结合性富含谷氨酸样蛋白(SH3BGRL)和人SH3结构域结合性富含谷氨酸蛋白(SH3BGR)表现出和hGHRGM蛋白的同源性最高。MOTIF搜寻揭示了三个基序。已知SH3BGR和SH3BGRL中富含脯氨酸的氨基酸序列在与信号转导通道相关的蛋白-蛋白相互作用中起重要作用。特异性的富含脯氨酸的共有序列结合SH3、WW和EVH1结构域。因此，认为具有这种脯氨酸富含序列的本专利技术化合物参与了产生GH和IGF-1生理性功能的信号转导。发现本专利技术DNA的mRNA转录本(其在软骨细胞中的表达通过GH处理而注意到)在异常细胞(如肿瘤细胞)中有强表达。另外，在用GH处理衰老细胞后，该mRNA在衰老细胞中的表达(与较年轻的细胞相比大大提高)恢复到在较年轻细胞中所见的水平。最近，已经注意通过给予GH药物制剂来治疗患GH分泌缺陷症的成人患者。本专利技术的DNA、DNA编码的蛋白质、针对该蛋白质的抗体、探针等可用作该治疗中的诊断试剂。另外，测定本专利技术蛋白的表达水平可用于监控患GH分泌缺陷症的儿童用GH治疗的效果。本专利技术的DNA、该DNA编码的蛋白质、针对该蛋白质的抗体、探针等也可用于此目的中的诊断试剂。本专利技术不仅包括具有序列表中SEQ ID NO1所示核苷酸序列的DNA，而且还包括构成具有相似性能的基因、相对于该核苷酸序列有一个或多个核苷酸缺失、取代或添加的DNA。术语“一个或多个核苷酸”通常指几个(例如3个或4个)至10个核苷酸碱基。另外，本专利技术不仅包括具有序列表SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白质，而且还包括具有相似性能的、相对于该蛋白的氨基酸序列有一个或多个氨基酸缺失、取代或添加的蛋白质。术语“一个或多个氨基酸”通常指几个(例如3个或4个)至10个氨基酸。本专利技术还包括编码这些蛋白的DNA序列。本领域技术人员易用众所周知的遗传密码子简并知识制得各种这样的核苷酸序列。利用重组DNA技术可获得各种突变体。首先，可以通过不同的化学和/或酶促方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ，它具有序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：古贺淳一，河野惠子，FN佐洛塔寥夫，
申请(专利权)人：日本化学研究株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]