家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用技术方案

本发明专利技术公开了家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子3信号肽序列；3’端为截断轻链结合位点；将该表达框用于表达目的蛋白，发现目的蛋白能够在丝腺及茧丝的丝素层表达，表明含信号肽的N端和C端截短后并不影响目的蛋白的表达及分泌；通过丝素N端和C端的解析为蚕丝的成丝机理提供了实验及理论基础，有利于创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，保持蚕丝产业可持续发展，促进我国蚕学和昆虫学科的长远发展。

【技术实现步骤摘要】
家蚕丝心蛋白重链表达系统及其制备方法和应用
本专利技术涉及生物
，特别是涉及一种家蚕丝心蛋白重链表达系统(N端仅含信号肽，C端含截短LBS)，还涉及该系统的制备方法和应用。
技术介绍
家蚕茧丝的主要组成是丝素(fibroin)和丝胶(sericin)两种蛋白，其中丝素是茧丝的主要成分，约占茧丝重的82％。丝素由家蚕的后部丝腺(PSG)细胞合成，丝胶由中部丝腺(MSG)细胞合成，它们都在中部丝腺聚集，最后经过前部丝腺(ASG)被榨丝后而吐丝结茧。丝素由350-kDa的重链蛋白(H-chain)，26-kDa的轻链蛋白(L-chain)和30-kDa的fibrohexamerin/P25(fhx)三种蛋白构成。这些蛋白在后部丝腺细胞内首先按照一定的比例(H-chain：L-chain：fhx＝6：6：1)形成丝素基本单元，然后丝素基本单位被分泌到丝腺腔。其中丝素基本单位由6个通过二硫键结合的重链、轻链(H-L)二聚体和1个P25糖蛋白分子组成。H-L二聚体在Fib-L的Cys-172和Fib-H的Cys-c20之间形成二硫键。一个P25糖蛋白和六个H-L二聚体通过与重链的N端结构域(NTD)的非共价相互作用在内质网上形成丝素基本单元。在丝素基本单位中重链蛋白是最主要的成分，达92％，并且是茧丝具有优良机械性能的原因所在，而轻链蛋白只占约7％，fhx约占1％。而丝素重链是由中间的12个结晶区域、11个非结晶区域和两端保守亲水的N端结构域(NTD)和C端结构域(CTD)组成。自从家蚕基因组框架图由中国家蚕基因组计划研究小组领导的率先完成后，它不但确立了我国家蚕功能基因组研究在国际上的地位，而且也为蚕丝业和昆虫学科的发展提供了新的契机。功能基因组时期的主要工作包括：主要功能基因的鉴定克隆，重要生物学性状的分子机理的阐明，最终实现重要经济性状的人为调节和创造。家蚕最重要的性状是家蚕的丝腺能在短时间高效地大量合成绢丝蛋白。利用家蚕丝腺的这一特点，在丝腺中高效表达外源蛋白一直是许多蚕学和生物学科技工作者追求的目标。而目前对于成丝机理的研究仍有很多细节需要科研工作者去解析，特别是在茧丝中占比最大且主要负责蚕丝机械性能的丝素重链其各元件在丝形成过程中发挥着怎样的作用更加需要进一步探究。利用鳞翅目来源的转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术最初在日本取得成功，而经过科研工作者的努力，我们也建立了系统而完善的家蚕胚胎显微注射转基因技术，为本研究的工作开展打下了良好的基础。在利用转座子piggyBac的家蚕胚胎显微注射转基因技术的研究报道中，有关利用家蚕丝素重链表达系统(N端仅含信号肽，C端含截短LBS)表达外源蛋白的方法未见报道，这也将进一步探究了丝素重链元件N、C端的作用，为蚕丝成丝机理的研究提供实验及理论基础。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的之一在于提供一种家蚕丝心蛋白重链表达系统；本专利技术的目的之二在于提供含有所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体；本专利技术的目的之三在于提供所述重组载体的制备方法；本专利技术的目的之四在于提供所述家蚕丝心蛋白重链表达系统或所述重组载体在表达目的蛋白中的应用。为达到上述目的，本专利技术提供如下技术方案：1、家蚕丝心蛋白重链表达系统，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-HP(s)；3’端为截短轻链结合位点LBS(s)；所述丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-HP(s)的核苷酸如SEQIDNO.1所示；所述截短轻链结合位点LBS(s)的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。2、含有所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体。优选的，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框通过BamHⅠ和HindⅢ酶切位点连入pSLfa1180fa载体而得。优选的，所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框连入pBac[3×P3DsRedaf]载体的AscⅠ和FseⅠ酶切位点处。3、所述重组载体的制备方法，所述重组载体由含有目的基因表达框连入pSLfa1180fa载体的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点处而得。优选的，所述重组载体的制备方法如下：先将截短轻链结合位点LBS(s)通过BamHI和SalI酶切位点连入pSLfa1180fa载体获得pSL-LBS(s)质粒，再将目的基因通过XbaI和BamHI连入pSL-LBS(s)质粒获得含目的基因的过渡载体，最后将丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-HP(s)通过BamHI和HindⅢ连入含目的基因的过渡载体获得家蚕丝心蛋白重链表达系统pSL-LBS(s)-目的基因-Fib-HP(s)。优选的，所述重组载体的制备方法如下：将所获得的重组载体利用限制性酶AscⅠ和FseⅠ插入到piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]载体内形成最终的注射载体。优选的，所述丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-HP(s)由SEQIDNO.3和SEQIDNO.4为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。优选的，所述截短轻链结合位点LBS(s)由SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示序列为引物，含有家蚕品种p50丝素基因的细菌人造染色体克隆为模板经PCR扩增而得。4、所述家蚕丝心蛋白重链表达系统或所述重组载体在丝素层表达目的蛋白中的应用。本专利技术的有益效果在于：首次开发和利用了家蚕丝素重链表达系统(N端仅含信号肽，C端含LBS(s))，将其用于表达目的蛋白，通过对转基因家蚕的鉴定及检测分析，获得与家蚕丝素重链表达系统在丝腺及茧丝的丝素层表达，表明在C端截短后并不影响目的蛋白的表达及分泌。通过丝素N端的解析为蚕丝的成丝机理提供了实验及理论基础，有利于创造真正实用的家蚕丝腺生物反应器，保持蚕丝产业可持续发展，促进我国蚕学和昆虫学科的长远发展。附图说明为了使本专利技术的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本专利技术提供如下附图进行说明：图1为转基因载体结构图(A：含有多克隆位点的穿梭载体pSLfa1180fa；B：piggyBac衍生载体pBac[3×P3DsRedaf]；C：获得的最终注射载体pBac[3×P3-DsRed-SV40-LBS(s)-EGFP-Fib-HP(s)])图2为获得的转基因家蚕荧光筛选(A：野生型和转基因家蚕复眼在白光和红色荧光下观察结果，a为野生型白光，b为野生型红色荧光，c为转基因家蚕白光，d为转基因家蚕红光；B：野生型和转基因家蚕蚕茧在白光和绿色荧光下观察，a为野生型白光，b为转基因家蚕白光，c为野生型绿色荧光，d为转基因家蚕绿色荧光；WT：野生型；TS-H-GC：转基因家蚕；Whitelight：白光；RFP-fluorescent：红色荧光；GFP-fluorescent：绿色荧光；GFPstd：绿色荧光蛋白标品)。图3为目的基因EGFP的SDS-PAGE电泳图及Westernblotting图(A：SDS-本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.家蚕丝心蛋白重链表达系统，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-H P

【技术特征摘要】
1.家蚕丝心蛋白重链表达系统，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统含有目的基因表达框，所述表达框5’端为丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-HP(s)；3’端为截短轻链结合位点LBS(s)；所述丝心蛋白重链启动子信号肽序列Fib-HP(s)的核苷酸如SEQIDNO.1所示；所述截短轻链结合位点LBS(s)的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。


2.含有权利要求1所述家蚕丝心蛋白重链表达系统的重组载体。


3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框通过BamHⅠ和HindⅢ酶切位点连入pSLfa1180fa载体而得。


4.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述家蚕丝心蛋白重链表达系统由含有目的基因表达框连入pBac[3×P3DsRedaf]载体的AscⅠ和FseⅠ酶切位点处。


5.权利要求3所述重组载体的制备方法，其特征在于：所述重组载体由含有目的基因表达框连入pSLfa1180fa载体的BamHⅠ和HindⅢ酶切位点处而得。


6.根据权利要求5所述重组载体的制备方法，其特征在于，制备方法如下：先将截短轻链结合位点LBS(s)通过BamHI和SalI酶切位点连入pSLfa118...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵爱春，郝占章，龙定沛，
申请(专利权)人：西南大学，重庆西蚕生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：重庆;50