一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，公开了一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂，用于癌症治疗中的药物为BTNL2单克隆治疗型抗体或为包含BTNL2单克隆治疗型抗体的组合物；BTNL2单克隆治疗型抗体为人BTNL2或小鼠BTNL2；人BTNL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.2；小鼠BTNL2的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO.4。本发明专利技术获得的杂交瘤(BTN‑1)产生的单克隆抗体可应用于免疫组织化学(IHC)、免疫印记(Western blot)、间接ELISA、抗体芯片制备等检测与筛查，特异性和灵敏度高。

【技术实现步骤摘要】
一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂
本专利技术属于生物医药
，尤其涉及一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：通过免疫检查点的人源化或者全人源抗体封闭该免疫检查点，从而达到激活免疫反应并杀伤肿瘤的效果。常用的免疫检查点有PD-1、PD-L1、CTLA4。肿瘤免疫治疗是通过不同的机制来激活人体免疫力，最终通过集体的特定免疫细胞来消灭肿瘤的方法。目前根据激活免疫系统的方法，肿瘤免疫治疗分为主动免疫治疗和被动免疫治疗。主动免疫治疗主要包括肿瘤疫苗，被动免疫治疗主要包括抗体药物治疗、免疫检查点抑制剂治疗、过继性免疫细胞治疗、细胞因子治疗等。目前最受关注的是免疫检查点抑制剂治疗。免疫检查点本是人体免疫系统中起保护作用的分子，起类似刹车的作用，防止T细胞过度激活导致的炎症损伤等。而肿瘤细胞利用人体免疫系统这一特性，通过过度表达免疫检查点分子，抑制人体免疫系统反应，逃脱人体免疫监视与杀伤，从而促进肿瘤细胞的生长。目前研究和应用最广泛的免疫检查点抑制剂包括CTLA-4、PD-1以及其配体PD-L1的抑制剂。免疫检查点抑制剂治疗通过抑制免疫检查点活性，释放肿瘤微环境中的免疫刹车，重新激活T细胞对肿瘤的免疫应答效应，从而达到抗肿瘤的作用，这也使其成为对抗肿瘤的新武器。临床上采用该疗法后，部分患者可以获得持久的临床疗效，并且在数年内无任何肿瘤有关的临床症状。目前主要的CTLA-4抑制剂有Ipilimumab、Tremelimumab等，其中Ipilimumab是最早获得FDA批准并用于临床的免疫检查点抑制剂。根据III期随机对照试验中获得的生存结果，美国FDA最终于2011年批准Ipilimumab用于治疗转移性黑色素瘤。目前FDA批准的PD-1抗体有Nivolumab和Pembrolizumab，分别用来治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌以及肾癌。2016年FDA提前四个月批准了罗氏旗下基因泰克的PD-L1抗体atezolizumab(商品名Tecentriq)，作为二线药物用于治疗一种叫做urothelialcarcinoma的最常见晚期膀胱癌。2017年FDA加速批准由德国默克公司与辉瑞共同研发的PD-L1抗体Bavencio(Avelumab)上市，用于治疗罹患转移性默克尔细胞癌(metastaticMerkelcellcarcinoma，MCC)的成人与12岁以上儿童，包括那些先前未经化疗治疗的患者。2017年美国FDA批准了默沙东公司的“”PD-1抗体Keytruda用于治疗携带一种特定基因特征的任何一种实体瘤。这是美国FDA批准的首款不依据肿瘤来源，而是依据生物标志物进行区分的抗肿瘤疗法。具体来说，Keytruda被批准用于治疗携带微卫星不稳定性高(microsatelliteinstability-high，MSI-H)或错配修复缺陷(mismatchrepairdeficient，dMMR)的成人和儿童实体瘤患者。目前，免疫检查点抑制剂PD-1、PD-L1和CTLA-4抗体正在开展上百种针对不同肿瘤的临床试验，有望在多种肿瘤的治疗上取得突破。尽管免疫检查点抑制剂在众多肿瘤治疗方面取得巨大的进步，但该疗法也存在一些不足，例如总体响应率较低，出现耐药等。因此，针对新的肿瘤免疫检查点的筛选十分必要。BTNL2(Butyrophin-like2)是BTNL家族成员之一，与B7家族蛋白具有较高的同源性。近年来一些遗传学研究发现该基因的单核苷酸多态性与众多疾病密切相关，如自身免疫疾病、肿瘤等。研究发现，BTNL2蛋白能够抑制T细胞的激活，提示BTNL2在免疫调节、耐受中发挥重要的作用。综上所述，现有技术存在的问题是：现有技术中，免疫检查点抑制剂总体响应率较低，出现耐药性。抗体的人源化水平较低，易出现免疫排斥反应；人源化抗体的亲和性较差，导致封闭活性较差。解决上述技术问题的难度和意义：针对其他检查点蛋白的封闭有可能提高治疗总体相应率；优化人源化可以减小排斥反应，使抗体发挥更好的作用；增加亲和性能够促进更好的封闭活性，更好的发挥药效。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种用于癌症治疗中的药物、肿瘤疫苗及抑制剂。本专利技术是这样实现的，一种用于癌症治疗中的药物，所述用于癌症治疗中的药物为BTNL2单克隆治疗型抗体，能够用于治疗多种人类癌症。所述BTNL2单克隆治疗型抗体为人BTNL2或小鼠BTNL2；人BTNL2的氨基酸序列为SEQIDNO.1，编码核苷酸序列为SEQIDNO.2；小鼠BTNL2的氨基酸序列为SEQIDNO.3，编码核苷酸序列为SEQIDNO.4。进一步，用于纯化抗体的BTNL2胞外区多肽为免疫原；BTNL2胞外区多肽分别为人BTNL2第24位亮氨酸到第455位丝氨酸、小鼠Ephrin-B1第24位赖氨酸到第454位丝氨酸，BTNL2胞外区多肽的编码核苷酸分别为SEQIDNO.2所示序列的69-1365位核苷酸、SEQIDNO.4所示序列的69-1362位核苷酸。进一步，由BTNL2胞外区与6XHis标签组成的融合多肽用于免疫原的纯化。本专利技术的另一目的在于提供一种所述用于癌症治疗中的药物包含的BTNL2单克隆治疗型抗体构建的表达融合抗原多肽的载体，所述载体为pINFUSE-hIgG2-Fc2(载体购自INVIVOGEN公司)，包含编码BTNL2胞外区的核苷酸。本专利技术的另一目的在于提供一种所述载体的构建方法，所述载体的构建方法包括：将编码BTNL2第24位亮氨酸到第455位丝氨酸的基因序列克隆并利用哺乳动物细胞表达纯化，作为免疫原，免疫大鼠；经与小鼠杂交瘤细胞融合、重组CP4EPSPS筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系；利用培养该杂交瘤细胞系收集培养上清，ProteinG柱亲和层析纯化培养上清，获得大鼠单克隆抗体；进行免疫印记Westernblot实验，分析大鼠单克隆抗体特异识别肿瘤细胞内源的BTNL2蛋白。本专利技术的另一目的在于提供一种验证所述用于癌症治疗中的药物疗效的动物模型构建方法，所述动物模型构建方法包括：第一步，选取8周龄雌性小鼠做动物实验；小鼠随机分为2-3组，每组10只，一组注射对照抗体，一组注射抗BTNL2抗体，另一组注射抗PD-L1抗体作为阳性对照；pINFUSE-hIgG2-His-BTNL2载体构建：通过合成小鼠BTNL2全cDNA序列，编码核苷酸序列如SEQIDNO.4，以此为模板，构建小鼠BTNL2胞外区表达载体，胞外区氨基酸为第24位赖氨酸到第454位丝氨酸；表达载体为pINFUSE-hIgG2-Fc2；PCR反应体系为：10XPCRbuffer：5μl，dNTP：1μl，上/下游引物：各1ul(10μM)，模板DNA：1ng，PFU：1μl总反应体系：50μl；PCR反应程序为本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于癌症治疗中的药物，其特征在于，所述用于癌症治疗中的药物为BTNL2单克隆治疗型抗体；/n所述BTNL2单克隆治疗型抗体的氨基酸序列为SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.3；SEQ IDNO.1的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.2；SEQ ID NO.3的编码核苷酸序列为SEQ ID NO.4。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于癌症治疗中的药物，其特征在于，所述用于癌症治疗中的药物为BTNL2单克隆治疗型抗体；
所述BTNL2单克隆治疗型抗体的氨基酸序列为SEQIDNO.1或SEQIDNO.3；SEQIDNO.1的编码核苷酸序列为SEQIDNO.2；SEQIDNO.3的编码核苷酸序列为SEQIDNO.4。


2.如权利要求1所述的用于癌症治疗中的药物，其特征在于，用于纯化抗体的BTNL2胞外区多肽为免疫原；BTNL2胞外区多肽为氨基酸序列SEQIDNO.1第24位亮氨酸到第455位丝氨酸或氨基酸序列SEQIDNO.3第24位赖氨酸到第454位丝氨酸，BTNL2胞外区多肽的编码核苷酸为SEQIDNO.2所示序列的69-1365位核苷酸或SEQIDNO.4所示序列的69-1362位核苷酸。


3.如权利要求1所述的用于癌症治疗中的药物，其特征在于，由BTNL2胞外区与6XHis标签组成的融合多肽用于免疫原的纯化。


4.一种如权利要求1所述用于癌症治疗中的药物包含的BTNL2单克隆治疗型抗体构建的表达融合抗原多肽的载体，其特征在于，所述载体为pINFUSE-hIgG2-Fc2，包含编码BTNL2胞外区的核苷酸。


5.一种如权利要求4所述载体的构建方法，其特征在于，所述载体的构建方法包括：将编码BTNL2第24位亮氨酸到第455位丝氨酸的基因序列克隆并利用哺乳动物细胞表达纯化，作为免疫原，免疫小鼠；经与小鼠杂交瘤细胞融合、重组CP4EPSPS筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系；
利用培养该杂交瘤细胞系收集培养上清，ProteinG柱亲和层析纯化培养上清，获得大鼠单克隆抗体；进行免疫印记Westernblot实验，分析小鼠单克隆抗体特异识别肿瘤细胞内源的BTNL2蛋白。


6.一种验证权利要求1所述用于癌症治疗中的药物疗效的动物模型构建方法，其特征在于，所述动物模型构建方法包括：
第一步，选取8周龄雌性小鼠做动物实验；小鼠随机分为2-3组，每组10只，一组注射对照抗体，一组注射抗BTNL2抗体，另一组注射抗PD-L1抗体作为阳性对照；
pINFUSE-hIgG2-His-BTNL2载体构建：
通过合成小鼠BTNL2全cDNA序列，编码核苷酸序列如SEQIDNO.4，以此为模板，构建小鼠BTNL2胞外区表达载体，胞外区氨基酸为第24位赖氨酸到第454位丝氨酸；表达载体为pINFUSE-hIgG2-Fc2；
PCR反应体系为：
10XPCRbuffer：5μl，
dNTP：1μl，
上/下游引物：各1ul(10μM)，
模板DNA：1ng，
PFU：1μl
总反应体系：50μl；
PCR反应程序为：
95℃5分钟，循环30次，72℃10分钟，4℃；
将PCR反应体系跑核酸电泳，切胶回收DNA片段；将切胶回收后的DNA片段和pINFUSE-hIgG2-Fc2空载体37℃酶切2小时，回收DNA片段。将回收后的DNA片段和载体进行16℃连接过夜；取5μl连接产物转化DH5α感受态细胞。转化平板放入37℃细菌孵箱过夜，第二天调取单克隆菌落，进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的菌落提质粒并送公司测序；测序正确的质粒将进行质粒中提，准备转染细胞；DNA切胶回收试剂盒以及DNA溶液回收试剂盒；
重组蛋白His-BTNL2的制备：
将构建好的表达载体pINFUSE-hIgG2-His-BTNL2转染入293F细胞，1L培养细胞，1×106/mL，在37℃、5％CO2、130rpm摇6天；转染后第6天收取细胞培养上清，离心去除细胞，4℃，1500rpm，5分钟，0.45μm滤膜过滤；将过滤后上清用His-tag纯化试剂盒纯化重组蛋白，超滤后蛋白融在1×PBS里，过0.22μm滤膜，测浓度，-80℃保存；
第二步，杂交瘤细胞系的建立：
a)免疫
将第一步中交联的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晨辉，杜艳芸，孙万伟，陈建文，
申请(专利权)人：华中科技大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42