细胞聚集体、细胞聚集体的混合物和它们的制造方法技术

本发明专利技术的目的在于提供适于移植的包含产多巴胺神经前体细胞的细胞聚集体、其混合物和它们的制造方法。本发明专利技术的细胞聚集体包含FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞，包含1000个以上的细胞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】细胞聚集体、细胞聚集体的混合物和它们的制造方法
本专利技术涉及细胞聚集体等黏附性细胞群体、该细胞群体的混合物和它们的制造方法。
技术介绍
帕金森病是由中脑黑质的产多巴胺神经细胞的脱落所引起的神经退行性疾病，目前在全世界约有400万的患者。作为帕金森病的治疗，进行了基于L-DOPA或多巴胺激动剂的药物治疗、基于脑立体定向手术的凝固术、深部电刺激治疗和胎儿中脑移植等。胎儿中脑移植存在其供给源的组织伦理问题而且感染危险性也高。近些年，提出了使用由胚胎干细胞(ES细胞)和诱导多能干细胞(iPS细胞)等多能干细胞分化诱导的产多巴胺神经细胞或作为其前体细胞的产多巴胺神经前体细胞的治疗法(非专利文献1)，也报道了其制造方法。具体而言，作为产多巴胺神经前体细胞的制造方法，提出了包括通过成为产多巴胺神经前体细胞或产多巴胺神经细胞的标记物的因子(具体而言Corin或Lrtm1)来筛选适于移植的细胞的工序的方法(专利文献1、非专利文献2和非专利文献3)，为了减小数量差的影响且确保品质均匀性、提高生产效率，需求进一步的改良。现有技术文献专利文献专利文献1：国际公开第2015/34012号非专利文献非专利文献1：WernigM，etal.，ProcNatlAcadSciUSA.2008，105:5856-5861非专利文献2：DoiD，etal.，StemCellReports.2014，2:337-350非专利文献3：SamataB，etal.，Naturecommunication.2016，7:1-11
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术的目的在于提供在大小和形状方面良好的神经细胞的细胞聚集体等黏附性细胞群体、包含该细胞群体的具有高均匀性的细胞聚集体或细胞群体的混合物、和它们的制造方法，具体而言包含产多巴胺神经前体细胞的细胞聚集体、具有高均匀性的该细胞聚集体的混合物、和它们的制造方法等。用于解决问题的方案本专利技术人等进行了深入研究，结果发现：经过使多个细胞悬浮于液体介质的连续流中并将该细胞分离成目标神经前体细胞和并非此细胞的细胞的工序，以使其分别流入各个液体介质的连续流，筛选目标神经前体细胞，对其进行培养来制造包含神经系统细胞的细胞聚集体，从而可以得到要求适当地管理细胞数、细胞的状态的、包含适于人移植用途的数量的神经系统细胞的细胞聚集体、和该细胞聚集体的均匀的混合物，以至完成了本专利技术。即，本专利技术涉及以下方案。[1]一种细胞聚集体，其包含FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞，且包含1000个以上的细胞。[2]根据[1]所述的细胞聚集体，其包含总细胞数的约70％以上的FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞。[3]根据[1]或[2]所述的细胞聚集体，其在培养时能抑制细胞死亡。[4]根据[1]～[3]中任一项所述的细胞聚集体，其进一步具有选自以下的至少一个特征：(a1)圆当量直径为100μm～2000μm，(a2)包络度为0.5以上，(a3)费雷特直径比为0.5以上，和(a4)圆形度为0.3以上。[5]根据[1]～[4]中任一项所述的细胞聚集体，其在表面不具有碎片层且在显微镜下细胞聚集体的交界线清晰。[6]一种细胞聚集体的混合物，其为多个细胞聚集体的混合物，且包含总细胞聚集体数的50％以上的[1]～[5]中任一项所述的细胞聚集体。[7]根据[6]所述的细胞聚集体的混合物，其在选自由圆形度、最小直径、最大直径、垂直费雷特直径或水平费雷特直径、费雷特直径比、圆当量直径、周长、面积、以及周长的包络度或面积的包络度组成的组中的指标中的1个以上的指标中，具有15％以下的变异系数。[8]一种黏附性细胞群体的混合物的制造方法，其包括如下工序：(1)在第一分化诱导因子的存在下对多个干细胞进行分化诱导，得到包含1个以上的处于第一分化阶段的神经前体细胞的多个细胞的工序；(2)从工序(1)中得到的多个细胞中选择性分离处于第一分化阶段的神经前体细胞的工序，该工序包括：在液体介质的连续流中，使工序(1)中得到的多个细胞悬浮，和识别处于第一分化阶段的神经前体细胞，将处于第一分化阶段的神经前体细胞与并非处于第一分化阶段的神经前体细胞分离，以使其分别流入各个液体介质的连续流；及(3)在第二分化诱导因子的存在下培养工序(2)中分离的处于第一分化阶段的神经前体细胞，从而得到黏附性细胞群体的混合物的工序，其中，黏附性细胞群体的混合物包含总黏附性细胞群体数的50％以上的具有以下的(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体，(b1)包含处于第二分化阶段的神经系统细胞；和(b2)包含1000个以上的细胞。[9]根据[8]所述的制造方法，其中，具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体在培养时能抑制细胞死亡。[10]根据[9]所述的制造方法，其中，将黏附性细胞群体培养14～20天时，培养结束时的细胞数为培养开始时的细胞数的5％以上、优选为10％以上。[11]根据[8]～[10]中任一项所述的制造方法，其中，黏附性细胞群体的混合物为细胞聚集体的混合物。[12]根据[11]所述的制造方法，其中，黏附性细胞群体为细胞聚集体，上述具有(b1)和(b2)的特征的细胞聚集体的圆当量直径为100μm～2000μm。[13]根据[12]所述的制造方法，其中，具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体为细胞聚集体，且还具有以下的特征：(b3)包络度为0.5以上，(b4)费雷特直径比为0.5以上，和(b5)圆形度为0.3以上。[14]根据[11]～[13]中任一项所述的制造方法，其中，细胞聚集体的混合物在选自由圆形度、最小直径、最大直径、垂直费雷特直径或水平费雷特直径、费雷特直径比、圆当量直径、周长、面积、以及周长的包络度或面积的包络度组成的组中的指标中的1个以上的指标中，具有15％以下的变异系数。[15]根据[8]～[14]中任一项所述的制造方法，其中，在工序(2)中，使用微通道式细胞分选仪将处于第一分化阶段的神经前体细胞分离。[16]根据[8～[15]中任一项所述的制造方法，其中，在工序(2)中，使处于第一分化阶段的神经前体细胞在封闭系统中分离。[17]根据[8]～[16]中任一项所述的制造方法，其中，干细胞为多能干细胞。[18]根据[8]～[17]中任一项所述的制造方法，其中，处于第一分化阶段的神经前体细胞是注定中脑底板命运的神经前体细胞。[19]根据[18]所述的制造方法，其中，处于第一分化阶段的神经前体细胞为Corin和/或Lrtm1阳性的细胞。[20]根据[8]～[19]中任一项所述的制造方法，其中，处于第二分化阶段的神经系统细胞为选自由TUJ1、OTX2、FOXA2、LMX1A、LMX1B、EN1、Nurr1、PI本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种细胞聚集体，其包含FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞，且/n包含1000个以上的细胞。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180219 JP 2018-0274551.一种细胞聚集体，其包含FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞，且
包含1000个以上的细胞。


2.根据权利要求1所述的细胞聚集体，其包含总细胞数的约70％以上的FOXA2阳性或TUJ1阳性的神经系统细胞。


3.根据权利要求1或2所述的细胞聚集体，其在培养时能抑制细胞死亡。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的细胞聚集体，其进一步具有选自以下的至少一个特征：
(a1)圆当量直径为100μm～2000μm，
(a2)包络度为0.5以上，
(a3)费雷特直径比为0.5以上，和
(a4)圆形度为0.3以上。


5.根据权利要求1～4中任一项所述的细胞聚集体，其在表面不具有碎片层且在显微镜下细胞聚集体的交界线清晰。


6.一种细胞聚集体的混合物，其为多个细胞聚集体的混合物，且包含总细胞聚集体数的50％以上的权利要求1～5中任一项所述的细胞聚集体。


7.根据权利要求6所述的细胞聚集体的混合物，其在选自由圆形度、最小直径、最大直径、垂直费雷特直径或水平费雷特直径、费雷特直径比、圆当量直径、周长、面积、以及周长的包络度或面积的包络度组成的组中的指标中的1个以上的指标中，具有15％以下的变异系数。


8.一种黏附性细胞群体的混合物的制造方法，其包括如下工序：
(1)在第一分化诱导因子的存在下对多个干细胞进行分化诱导，得到包含1个以上的处于第一分化阶段的神经前体细胞的多个细胞的工序；
(2)从工序(1)中得到的多个细胞中选择性分离处于第一分化阶段的神经前体细胞的工序，该工序包括：
在液体介质的连续流中，使工序(1)中得到的多个细胞悬浮，和
识别处于第一分化阶段的神经前体细胞，将处于第一分化阶段的神经前体细胞与并非处于第一分化阶段的神经前体细胞分离，以使其分别流入各个液体介质的连续流；及
(3)在第二分化诱导因子的存在下培养工序(2)中分离的处于第一分化阶段的神经前体细胞，从而得到黏附性细胞群体的混合物的工序，其中，
黏附性细胞群体的混合物包含总黏附性细胞群体数的50％以上的具有以下的(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体，
(b1)包含处于第二分化阶段的神经系统细胞；和
(b2)包含1000个以上的细胞。


9.根据权利要求8所述的制造方法，其中，具有(b1)和(b2)的特征的黏附性细胞群体在培养时能抑制细胞死亡。


10.根据权利要求9所述的制造方法，其中，将黏附性细胞群体培养14～20天时，培养结束时的细胞数为培养开始时的细胞数的5％以上。


11.根据权利要求8～10中任一项所述的制造方法，其中，黏附性细胞群体的混合物为细胞聚集体的混合物。


12.根据权利要求11所述的制造方法，其中，黏附性细胞群体为细胞聚集体，所述具有(b1)和(b2)的特征的细胞聚集体的圆当量直径为100μm～2000μm。


13.根据权利要求12所述的制造...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉田贤司，吉川学，关谷明香，
申请(专利权)人：大日本住友制药株式会社，
类型：发明
国别省市：日本;JP