本发明专利技术公开了一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用，涉及农业栽培技术领域，本发明专利技术发现了一种与梨树叶片铁含量相关的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，同时本发明专利技术提供了一种利用上述序列对梨树黄化病因进行检测的方法，该方法具体包括采集梨树的cDNA，设计引物扩增上述序列后，对扩增产物采用不同的引物对扩增获得两种不同扩增产物，并进行载体制作，最终制备两种重悬液分别注射入黄化梨树的黄化叶和正常叶内，根据注射后的结果，可迅速判断梨树黄化是否为缺铁所致，本发明专利技术提供的方法简单有效，为治疗梨树黄化提供了有效的判定依据。
【技术实现步骤摘要】
一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用
本专利技术涉及农业栽培
，尤其涉及一种与梨树黄化病相关的基因及判断梨树叶黄化病原因的方法。
技术介绍
我国是世界梨树种植大国，其栽培面积和产量稳居世界第一。黄河故道地区是我国重要的梨树栽培区之一，多为碱性土壤，梨园缺铁引起的黄叶病发生较为普遍。近年来，在南方酸性土壤的沙梨园，缺铁引起的黄叶病也有发生，成为产业发展中重要的生理病害之一。梨树黄叶病的诊断过去主要采用土壤中Fe含量的测定和叶片中Fe含量的测定，与土壤中、叶片中Fe的丰缺指标做比较来判断是否缺铁。然而土壤Fe含量的测定技术缺点是受土壤酸碱度的影响很大，往往是土壤中Fe含量很高，但植株仍然表现为黄叶病，主要是土壤呈碱性，Fe容易形成难溶的铁矿盐沉淀所造成，且五点取样法工作量大；叶片Fe含量的测定技术缺点是在测定过程中溶Fe试剂容易被氧化，误差大，且不同品种叶片中Fe含量差异也大，目前我们参考的叶分析适宜值还没有划分到各个品种。因此，提供一种能够便捷的判断梨树叶黄化是否为缺铁导致的方法，是本领域技术人员急需的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用，以解决现有技术中梨树叶黄化原因无法迅速判断的技术问题。为了实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现的：本专利技术首先提供一种与梨树叶片含铁量相关的基因，所述基因的核苷酸序列具体为SEQIDNO.1。本专利技术还提供一种用于扩增上述基因的特异性引物对，所述引物对具体为：LOC-F:ctgtgagtcagtctaggaacccagSEQIDNO.2LOC-R:agagaagtccctgtcaccataggtSEQIDNO.3。本专利技术还提供一种利用上述基因鉴定梨树叶黄化原因的方法，该方法包括以下步骤：步骤一、提取梨树cDNA步骤二、利用LOC-F/R引物对对步骤1获取的cDNA进行PCR扩增，获得扩增产物A步骤三、采用LOC-OF/OR、LOC-SF/SR两组引物对分别对扩增产物A进行PCR扩增，获得扩增产物B和扩增产物C其中：LOC-OF：gagaacacgggggactctagaatggctgcaccgccgccaSEQIDNO.4LOC-OR：gcccttgctcaccatggatccagagtcagattggggtataatttgattSEQIDNO.5LOC-SF：ggcaaatctgtccccaacSEQIDNO.6LOC-SR：ctctgtggtgccaaattctaSEQIDNO.7步骤四、分别构建包含扩增产物B的超表达载体和包含扩增产物C的VIGS沉默载体步骤五、分别配置包含扩增产物B的超表达载体的超表达重悬液和包含扩增产物C的VIGS沉默载体的VIGS重悬液步骤六、采集有黄化迹象的梨树的树叶，并分为黄化叶片组与正常叶片组步骤七、在黄化叶片组中注射超表达重悬液，在正常叶片组中注射VIGS重悬液，若注射超表达重悬液的黄化叶片复绿且注射VIGS重悬液的正常叶片黄化，则对应梨树黄化的原因为缺铁所致。进一步，步骤一具体为：用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，从梨叶中获取叶片RNA，并以普通反转录试剂盒合成叶片cDNA。进一步，步骤二和步骤三的PCR扩增体系为：反应组分总体积50μL，含有25μL2×KODNeobuffer，1μL叶片cDNA，10μL2mMdNTPs，1μL0.50μM对应引物，1μLKODNeo，加去离子无菌水至终体积；C1000梯度热循环基因扩增仪进行扩增，反应条件为：95℃初始变性3分钟；95℃持续30秒，连续变性40个循环，60℃下退火30秒，并在72℃持续30秒；最后72℃延伸10分钟。进一步，步骤4具体为针对扩增产物B用1300载体进行超表达载体构建，针对扩增产物C用TRV2载体进行VIGS沉默载体构建。进一步，步骤五中VIGS重悬液组分为1mL1MMgCl2，1mL1MMES，200μL200mM乙酰丁香酮，加去离子灭菌水至终体积100mL；超表达重悬液组分为1/2MS、20g/L蔗糖、2mL200mM乙酰丁香酮/L、10mL1MMES/L。进一步，步骤七具体为用无菌注射器从黄化的梨树叶背将对应重悬液注入叶片局部至其呈现水渍状。本专利技术还提供一种上述序列用于判断梨树叶黄化是否为缺铁导致的应用。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术提供一种与梨树叶片含铁量相关的基因及其应用，通过分子手段，发现了与梨树叶铁含量相关的基因，为研究梨树叶黄化原因提供了新的研究方法；其次，通过针对上述基因开发出了两对特异性引物对后，通过将对应的扩增产物导入相应的载体，并构建包含载体的重悬液后，注入黄化的梨树叶，并通过注入后梨树叶的表现，可以准确的判断梨树叶黄化是否因缺铁导致，避免了传统判断方法的繁琐，提高了判断的准确率。附图说明图1为实施例步骤3的电泳结果示意图，其中M：Marker；1：LOC-S沉默载体片段；2：LOC-O超表达载体片段。具体实施方式为了使本
的人员更好地理解本申请方案，下面将结合本申请实施例，对本申请的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本申请保护的范围。需要说明的是，本申请的说明书和权利要求书中的术语“包括”，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤的方法不必限于清楚地列出的那些步骤，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些方法固有的其它步骤。在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考实施例来详细说明本申请。实施例(1)cDNA提取用多糖多酚植物总RNA提取试剂盒(DP441-RNApreppure，天根)，从梨叶中获取叶片RNA，并以普通反转录试剂盒(AH311-02，全式金)合成叶片cDNA。使用BeckmanCoulterDU800紫外可见分光光度计(Beckman,Pasadena,CA,USA)检查各叶样的cDNA浓度。以RNase-FreeH2O将cDNA浓度调节至2000ng/μL，-80℃保存备用。(2)PCR反应反应组分总体积50μL，含有25μL2×KODNeobuffer(TOYOBO)，1μL上述样本cDNA，10μL2mMdNTPs，1μL0.50μMLOC-F/R特异引物，1μLKODNeo，加去离子无菌水至终体积。C1000梯度热循环基因扩增仪(Bio-RadLaboratoriessrl)进行扩增，反应条件为：95℃初始变性3分钟；95℃持续30秒，连续变性40个循环，60℃下退火30秒，并在72℃持续30秒；最后72℃延伸10分钟；并再次以该反应本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种与梨树叶片含铁量相关的基因，所述基因的核苷酸序列具体为SEQ ID NO.1。/n
【技术特征摘要】
1.一种与梨树叶片含铁量相关的基因，所述基因的核苷酸序列具体为SEQIDNO.1。
2.一种用于扩增权利要求1所述基因的特异性引物对，其特征在于，所述引物对具体为：
LOC-F:ctgtgagtcagtctaggaacccagSEQIDNO.2
LOC-R:agagaagtccctgtcaccataggtSEQIDNO.3。
3.一种利用权利要求1所述基因鉴定梨树叶黄化原因的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一、提取梨树cDNA
步骤二、利用LOC-F/R引物对对步骤1获取的cDNA进行PCR扩增，获得扩增产物A
步骤三、采用LOC-OF/OR、LOC-SF/SR两组引物对分别对扩增产物A进行PCR扩增，获得扩增产物B和扩增产物C
其中：
步骤四、分别构建包含扩增产物B的超表达载体和包含扩增产物C的VIGS沉默载体
步骤五、分别配置包含扩增产物B的超表达载体的超表达重悬液和包含扩增产物C的VIGS沉默载体的VIGS重悬液
步骤六、采集有黄化迹象的梨树的树叶，并分为黄化叶片组与正常叶片组
步骤七、在黄化叶片组中注射超表达重悬液，在正常叶片组中注射VIGS重悬液，若注射超表达重悬液的黄化叶片复绿且注射VIGS重悬液的正常叶片黄化，则对应梨树黄化的原因为缺铁所致。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤一...
【专利技术属性】
技术研发人员：贾兵，郭国凌，魏鹏飞，朱立武，叶振风，衡伟，刘莉，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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