蛋白质、病毒快速富集方法技术

本发明专利技术涉及一种蛋白质、病毒快速富集方法，适用于从人或动物的各种样品。它由以下操作步骤构成：１）蛋白絮凝：稀释样品释放蛋白质、病毒颗粒，加凝集溶剂，使蛋白质、病毒颗粒和细胞形成凝集物；２）分相沉淀：加分相溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到相间；３）二次沉淀：加沉淀溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到管底；４）弃清留沉：弃上清，洗涤，离心，再弃上清，再离心，吸尽上清得富集液。本发明专利技术方法构思合理，操作简单易行，富集速度快，可在１０～２０分钟完成。可浓缩约１００倍，使蛋白质、病毒检出率、准确率提高１００～１０００倍。特别是富集速度快，对于控制高传染性病毒流行具有重要意义。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种，适合从人或动物的各种样品(包括漱口液、培养上清、尿液、粪便抽提液、血清、咳痰抽提液、鼻拭子抽提液、咽拭子抽提液)，以及其它动植物试样中快速富集并部分纯化蛋白质、病毒颗粒的方法。
技术介绍
在化验所需的样品中，蛋白质、病毒的数量相差很大。如因病毒致患病人在不同病程的尿液、粪便、血清等临床样品以及潜伏期病人中的病毒数量就极少。目前的检验方法对样品体积大小都有一定的限制，不能从大体积的样品中提取蛋白质、病毒RNA，常常导致假阴性的检测结果。中国专利文献CN1285878公开了一种“用于富集和寻找微生物样品的方法和装置”，该方法对微生物的富集培养是在注射器或同等物中完成的，由于常规培养周期较长，不适应快速检测的需要。对蛋白质、病毒颗粒进行快速浓缩和部分纯化技术，中国医学文献和中国专利文献未见公开报道。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题是，克服已有技术所存在的不足，提供一种从大体积样品中对蛋白质、病毒颗粒浓缩和部分纯化速度快，浓缩率高的，使蛋白质、病毒检出率和准确性大大提高。本专利技术，其特征在于在由以下操作步骤构成1)蛋白絮凝稀释样品释放蛋白质、病毒颗粒，加凝集溶剂，使蛋白质、病毒颗粒和细胞形成凝集物；2)分相沉淀加分相溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到相间；3)二次沉淀加沉淀溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到管底；4)弃清留沉弃上清，洗涤，离心，再弃上清，再离心，吸尽上清得富集液。上述操作步骤一般在10～20分钟完成。在含蛋白质、病毒颗粒的样品中加入凝集溶剂，使蛋白质、病毒颗粒呈脱水状态或部分盐析而得到保护。加入分相溶剂后，立即形成二相体系，下相的水分被抽提到上相，而下相的凝集溶剂几乎达到100％的饱和度，蛋白质在两相中均不相容，而被有效地析出形成沉淀分布在相间，并在离心过程中沉淀到相间。加入沉淀溶剂消除两相，再经离心沉淀回收蛋白质、病毒颗粒。同时蛋白质、病毒颗粒也得到部分纯化(如粪便中的细菌、食物残渣及RT-PCR抑制物都被去除)，使检测灵敏性得到进一步的提高。用50％乙醇(或异丙醇)洗涤去除残留的盐离子后，蛋白质、病毒颗粒沉淀即可用于蛋白质、病毒RNA的纯化。另外，分相溶剂能直接杀死病毒，减少实验室感染的危险；凝集溶剂和分相溶剂均能抑制RNA酶活性，防止RNA的降解。所述的蛋白质凝集溶剂是90～100％饱和度的硫酸铵；所述的分相溶剂是异丙醇∶无水乙醇＝3～10∶1；所述的蛋白质沉淀溶剂是10～30％聚乙二醇6000；如果在蛋白质凝集溶剂中添加有80mM NaH2PO4和80mM Na2HPO4，在分相溶剂中添加有冰乙酸2～5ml/L则富集效果更好。这可以降低PH值，促使凝结块更加紧实，易于沉淀回收。所述的分相溶剂和离心机预冷后使用，其分相效果更好，预冷通常不高于10℃。根据不同的样品体积，它和三种溶剂一般有如下比例关系，即样品体积∶凝集溶剂体积∶分相溶剂体积∶沉淀溶剂体积＝5∶2～3∶6～8∶5～6；操作中常用比例关系为5∶2∶6.5∶5。为了规范操作，各样品体积都需要定量，并符合上述比例关系。I类样品5ml中凝集溶剂加量是2ml；分相溶剂加量是6.5ml，沉淀溶剂加量是5ml；II类样品2ml中凝集溶剂加量是0.8ml；分相溶剂加量是2.5ml，沉淀溶剂加量是2ml。上述I类样品是指漱口液，培养上清，尿液，粪便抽提液；II类样品是指血清，咳痰抽提液，鼻拭子抽提液，咽拭子抽提液。本专利技术方法构思合理，操作简单易行，从大体积样品中对蛋白质、病毒颗粒浓缩和部分纯化速度快，可浓缩约100倍，使蛋白质、病毒检出率、准确率提高100～1000倍。特别是富集速度快，对于控制高传染性病毒流行具有重要意义。具体实施例方式下面通过实施例，对本专利技术的技术方案作进一步具体的说明。一、富集实验准备从所有样品中富集蛋白质、病毒颗粒需作如下准备1.含消毒液的废物缸。2.吸管。3. 4℃预冷分相溶剂。4. 50％乙醇，4℃预冷。5.将离心机预冷至4℃。从各种样品中富集蛋白质、病毒颗粒分别作以下准备1.漱口液、培养上清、尿液50ml离心管。2.血清15ml离心管。3.粪便50ml离心管；生理盐水或PBS。4.咳痰50ml离心管；生理盐水或PBS，使用前加乙酰半胱氨酸(acetylcysteine)至终浓度为1％。5.鼻拭子15ml离心管；生理盐水或PBS。6.咽拭子15ml和50ml离心管；生理盐水或PBS。其中，生理盐水0.9％NaCl；PBS1.44g Na2HPO4·2H2O(或1.15g Na2HPO4)，0.2g KH2PO4，0.2g KCl，8.0g NaCl，加水至1升，调节pH至7.2，高压灭菌。本例的蛋白质、病毒凝集溶剂是96％饱和度的硫酸铵；分相溶剂是异丙醇∶无水乙醇＝3∶1；蛋白质、病毒沉淀溶剂是10％聚二醇6000。二、操作步骤此操作步骤是按以下体积的样品为例而设计的 A.5ml漱口液、培养上清、尿液、粪便抽提液；B.2ml血清、咳痰抽提液、鼻拭子抽提液、咽拭子抽提液。(一)从I类样品——漱口液、培养上清、尿液、粪便抽提液中富集蛋白质、病毒颗粒1、蛋白絮凝释放蛋白质、病毒颗粒，加凝集溶剂A.漱口液、培养上清、尿液取5ml样品，转入50ml离心管中，加2ml凝集溶剂。B.新鲜粪便(1)称取2克样品，转入50ml离心管中。(2)加6ml生理盐水或PBS，用吸管搅拌捣碎，再反复吹打彻底混合均匀(注意，勿溅到管外)，充分释放蛋白质、病毒颗粒。4℃，5000×g离心5分钟。(3)吸取5ml上清，转入50ml离心管中，加2ml凝集溶剂。2、分相沉淀加6.5ml 4℃预冷的分相溶剂，用吸管反复吹打混匀，室温静置5分钟后剧烈振摇混合均匀。4℃，≥5000×g离心5分钟，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到相间。注意分相溶剂能杀死蛋白质、病毒。为防止实验室污染，加入凝集溶剂和分相溶剂后勿先剧烈震摇，以免溅出，造成污染。宜用吸管吹打混匀，并等待分相溶剂作用5分钟杀死蛋白质、病毒颗粒后再剧烈振摇混合均匀。3、二次沉淀加5ml沉淀溶剂，混合均匀，4℃，≥5000×g离心3分钟，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到管底。4、弃清留沉倒置离心管丢弃上清，加5ml 4℃预冷的50％乙醇，轻轻转动离心管洗下沾在管壁上的溶液(勿搅动管底沉淀)。4℃，≥5000×g离心3分钟。倒置离心管丢弃上清，简短离心，用滴头吸尽残留的上清。注意，勿吸走管底沉淀。沉淀的蛋白质、病毒颗粒应立即用于RNA纯化，或置-20℃保存。(二)从从II类样品——血清、咳痰抽提液、鼻拭子抽提液或咽拭子抽提液中富集蛋白质、病毒颗粒 1、蛋白絮凝释放蛋白质、病毒颗粒，加凝集溶剂A.血清取2ml血清，加入15ml离心管中，加0.8ml凝集溶剂。B.咳痰(1)收集咳痰，转入50ml离心管中。(2)加3ml含1％乙酰半胱氨酸(acetylcysteine)的生理盐水或PBS，旋涡振荡3～10分钟(旋涡振荡时间视咳痰的粘稠度而定)，充分释放蛋白质、病毒颗粒。≥5000×g离心5分钟。(3)吸取2ml上清，转入15ml离心管中，加0.8ml凝集溶剂。C.鼻拭子(1)将鼻拭子转入15ml离心管中。(2)加3ml生理盐水或PBS，旋涡振荡1分钟充分释放蛋白质、病毒颗本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白质、病毒快速富集方法，其特征在于在由以下操作步骤构成：１）蛋白絮凝：稀释样品释放蛋白质、病毒颗粒，加凝集溶剂，使蛋白质、病毒颗粒和细胞形成凝集物；２）分相沉淀：加分相溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到相间； ３）二次沉淀：加沉淀溶剂，将蛋白质、病毒颗粒和细胞沉淀到管底；４）弃清留沉：弃上清，洗涤，离心，再弃上清，再离心，吸尽上清得富集液。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：余伟明，
申请(专利权)人：余伟明，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]