黑色素瘤表位（Mage-1,HLA-A1)与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白及其应用制造技术

黑色素瘤表位（Ｍａｇｅ－１，ＨＬＡ－Ａ１）与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白及其应用。本发明专利技术属于生物工程中的ＤＮＡ重组技术领域。本发明专利技术利用ＤＮＡ重组技术，将黑色素瘤表位（Ｍａｇｅ－１，ＨＬＡ－Ａ１）基因片段插入到整合有丝状噬菌体主要外壳蛋白基因的载体中，构建成新的重组载体。在宿主菌中，表位基因产物被分泌到细胞外，并组装于噬菌体外壳蛋白中，形成杂合蛋白。可以作为一种抗原与多种肿瘤患者血清中的抗体产生免疫应答。在模型鼠体内产生了细胞免疫和特异性的ＣＴＬ反应，在肿瘤模型鼠的免疫保护和预防实验中推迟了肿瘤的发生时间，提高了存活率。该杂合蛋白在制备诊断、预防和治疗肿瘤的药品方面具有良好的应用。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,HLA-A1)与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白及其应用的制作方法
本专利属于利用生物工程中的DNA重组技术产生的生物制品及其应用。
技术介绍
肿瘤是仅次于心血管疾病的世界第二号″杀手″疾病。截至到1999年底，全球肿瘤病人总数已逾4000万人。我国每年有130万人死于肿瘤。目前，还缺少无法对肿瘤的发生进行有效地诊断、预防和治疗的药品。黑色素瘤表位，Mage-1，HLA-A1，是一种只存在于肿瘤细胞表面而不存在于除睾丸以外的正常细胞表面的特异性抗原。将这种表位基因片段插入到整合有丝状噬菌体主要外壳蛋白基因的载体中，构建成新的重组载体。这种重组载体被转入宿主菌，大肠杆菌中，在辅助噬菌体存在的条件下，肿瘤表位基因产物被分泌到细胞外，并组装于噬菌体外壳蛋白中，形成具有杂合蛋白。利用噬菌体展示外源多肽技术的优点是有效地实现了基因型和表型的体外转换，使研究者完全可以在基因分子克隆的基础上有效地实现蛋白质构象的体外控制，在体外获得具有良好生物学活性的表达产物。这种新型的基因工程技术在制备生物制品方面具有简便、快速、灵敏、成本低等优点。
技术实现思路
本专利技术的目的是确立一种能够用于制备肿瘤临床检测，治疗和预防药品的生物制品。本专利技术的杂合蛋白是含有人类黑色素瘤抗原-1的HLA-A1限制型(Mage-1，HLA-A1)表位的丝状噬菌体基因8杂合外壳蛋白。这种杂合蛋白基因的核苷酸序列为ATG AAA AAG TCT TTA GTC CTC AAA GCC TCC GTA GCC GTT GCT ACC CTCGTTCCG ATG CTG TCT TTC GCC GCG GAA GCA GAC CCC ACC GGC CAC TCCTATGAC AAG GCG GCC TTT GAC TCC CTG CAA GCC TCA GCG ACC GAA TATATCGGT TAT GCG TGG GCG ATG GTT GTT GTC ATT GTC GGC GCA ACT ATCGGTATC AAG CTG TTT AAG AAA TTC ACC TCG AAA GCA AGC 这种杂合蛋白的氨基酸序列为Met Lys Lys Ser Leu Val Leu Lys Ala Ser Val Ala Val Ala Thr LeuValPro Met Leu Ser Phe Ala Ala Glu Ala Asp Pro Thr Gly His SerTyrAla Lys Ala Ala Phe Asp Ser Leu Gln Ala Ser Ala Thr Glu TyrIleGly Tyr Ala Trp Ala Met Val Val Val Ile Val Gly Ala Thr IleGlyIle Lys Leu Phe Lys Lys Phe Thr Ser Lys Ala Ser，HLA-A1)与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白的制备包括以下步骤第一步，构建表达载体和重组载体。原始质粒为pfd8WF。用SacII和StuI两种限制性内切酶处理原始质粒，然后将人工合成的寡核苷酸片段插入到经酶处理的质粒载体，获得重组载体pfd8Mg1-A1。第二步，合成黑色素瘤表位1(MAGE-1，HLA-A1限制型)的基因序列，并在序列两端加上酶切位点。用商业公司的DNA合成仪进行人工合成。该表位基因的序列为反意链3’-AAG CAG ACC CCA CCG GCC ACT CCT ATG-5’正意链5’-CAT AGG AGT GGC CGG TGG GGT CTG CTT-3’第三步，将重组载体转入宿主细胞。宿主细胞为带有F因子的大肠菌株TG1菌株。获得的转化体为新的工程菌株，TG1Mg1A1。第四步，制备杂合蛋白。培养工程菌株，经过离心、沉淀等步骤可获得该专利技术的杂合蛋白。免疫检测杂合蛋白可以作为一种抗原与多种肿瘤患者血清中的抗体产生免疫应答用本专利技术制备的杂合蛋白为抗原，采用免疫检测方法(如ELISA，斑点杂交)，可以检测到临床肿瘤(比如，胃癌、结肠瘤、肝癌、乳腺癌和肺癌等)病人血清中的相关抗体。说明该杂合蛋白可以用来制备肿瘤临床的检测药物。1.动物模型免疫预防杂合蛋白在小鼠体产生了细胞免疫和特异性的CTL反应用51Cr释放法、3H-TdR掺入法和MTT法测定了杂合蛋白免疫小鼠体内的细胞免疫变化。结果表明，NK细胞的杀伤活性和淋巴细胞转化能力均得到明显增强，并诱发了特异性CTL反应和较强的迟发型超敏反应。说明该杂合蛋白可以用来制备肿瘤临床的预防和治疗的药物。2.动物模型免疫保护杂合蛋白在模型鼠的免疫保护实验中表现出保护作用。1)杂合蛋白能够推迟肿瘤的发生时间5-7天；2)杂合蛋白将免疫模型鼠的存活率提高了50％(接种后33天的数据)。说明该杂合蛋白可以用来制备肿瘤临床的治疗免疫药物。具体实施例方式本专利技术的实施例包括以下内容1.表位基因的合成利用商业生物公司的DNA合成仪进行表位基因片段(AAGCAGACCCCACCGGCCACTCCTATG)的合成。2.重组载体的构建利用已公开的质粒pfd8sy为原始质粒，进行重组载体的构建。1)取pfd8sy质粒5μg，加入1-2μL的SacII酶，然后加入缓冲液和无菌水至总体积200μl。37℃保温24小时。酶切后，用常规方法抽提质粒DNA。抽提后，用乙酸胺和二倍体积的乙醇沉淀DNA，并溶于50μL TE液中。2)用第二种限制性内切酶Sty I处理已经第一种酶切的质粒DNA，方法同上。3)双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳，测定载体浓度。4)载体与人工合成的外源DNA片段按摩尔浓度1∶3混合。10μL混合液加入0.5μLT4DNA连接酶和1μL缓冲液。在15-20℃条件下，培养过夜，获得重组载体(pfd8M1-HLA-A1)。3.制备感受态细胞将TG1细胞培养于LB培养基上，37℃培养16-20小时。挑选单菌落接种于2ml LB液培养基中，37℃培养过夜。培养液转入100ml新鲜LB培养液中，37℃培养5小时。5000rpm离心15分钟。用8ml预冷的0.1mol/L CaCl2悬浮沉淀，获感受态细胞。4.重组载体转化宿主细胞取浓度约为150μg/mL的重组载体DNA溶液1.25μL；加入100μl的感受态细胞，置于碎冰中15分钟；加入600μl LB培养液，置于37℃恒温条件培养1小时；10000rpm离心5分钟；弃上清，将剩余部分涂于含氨苄青霉素的LB培养基表面，37℃恒温箱中培养过夜。选在培养平面生长的单菌落，进行扩大培养和低温保存(-70℃)。5.杂合蛋白的制备取冻存的转化细胞在LB平板上划线培养，过夜；选单菌落接种于含氨苄青霉素的3ml LB培养液中，37℃培养过夜；将培养液转入80-100ml LB培养液中继续培养，并加入IPTG(终浓度为0.5-1mM/mL)，37℃培养30分钟；离心(10 000rpm)10分钟；沉淀用培养液重新悬浮，37℃培养2-4小时；离心(8000rmp)20分钟，弃上清，用TE液悬浮沉淀；离心(5000rmp)20分钟，取上清，并加入20％聚乙二醇和2.5mol/L氯化钠。冷环境中放置4-5小时，离心(8000rmp)10分钟；弃上清，用TE液悬浮沉淀，获本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种黑色素瘤表位（Ｍａｇｅ－１，ＨＬＡ－Ａ１）与噬菌体外壳蛋白的杂合蛋白，其特征在于将黑色素瘤抗原ＭＡＧＥ－１（ＨＬＡ－Ａ１限制型）表位展示于丝状噬菌体主要外壳蛋白表面，形成的杂合蛋白，此蛋白的氨基酸结构序列为：ＭｅｔＬｙｓ ＬｙｓＳｅｒＬｅｕＶａｌＬｅｕＬｙｓＡｌａＳｅｒＶａｌＡｌａＶａｌＡｌａＴｈｒＬｅｕＶａｌＰｒｏＭｅｔＬｅｕＳｅｒＰｈｅＡｌａＡｌａＧｌｕＡｌａ ＡｓｐＰｒｏＴｈｒＧｌｙＨｉｓＳｅｒＴｙｒＡｌａＬｙｓＡｌａＡｌａＰｈｅＡｓｐＳｅｒＬｅｕＧｌｎＡｌａＳｅｒＡｌａＴｈｒＧｌｕＴｙｒＩｌｅ　 　ＧｌｙＴｙｒＡｌａＴｒｐＡｌａＭｅｔＶａｌＶａｌＶａｌＩｌｅＶａｌＧｌｙＡｌａＴｈｒＩｌｅＧｌｙＩｌｅＬｙｓＬｅｕＰｈｅＬｙｓＬｙｓＰｈｅＴｈ ｒＳｅｒＬｙｓＡｌａＳｅｒ。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽，房金波，
申请(专利权)人：东北师范大学，
类型：发明
国别省市：82[中国|长春]