一种快速定量测定灵芝中三萜类化合物含量的方法，其特征在于：用紫外分光光度法对灵芝三萜类化合物进行快速、定量的测定。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术为，特别是指用紫外分光光度法来快速、定量测定的方法，涉及生物
二.
技术介绍
有关灵芝多糖类成分的分离纯化，成份结构、药理、免疫抗肿瘤活性的研究及临床应用已广泛见诸文献，对于三萜类化合物的分离纯化、结构鉴定和生物活性也有一些报道，并且一直是国际上灵芝研究的一个重要方向，其生物活性包括抑制肿瘤细胞增殖、抗病毒、抑菌、镇痛、保肝护肝等。灵芝中三萜类化合物的提取工艺大致为灵芝子实体精粉经过乙醇提取，氯仿溶解，饱和NaHCO3萃取，HCl酸化，氯仿萃取，减压蒸馏干燥等步骤，即可得到淡黄色固体结晶。(参见王帮武等。灵芝酸性组份的提取分离及抑菌活性研究。北京理工大学学报，2002，22(1)125-128)目前国内市场上灵芝产品种类繁多，很多产品以三萜类作为功效组份。由于对此类活性组份还没有简单实用的检测方法，导致无法对其质量进行快速有效的检测和定量测定，因此市场上经常出现名不副实的宣传。本专利技术描述的是用紫外分光光度法来快速测定灵芝供试品中三萜类物质含量的一种方法，具有缩短测定时间，简化检测工艺，重复性好，成本较低，实施容易等优点。三.
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立一种用紫外分光光度法快速定量测定灵芝供试品中三萜类化合物含量的方法。1.本专利技术所用仪器为紫外可见双光束分光光度计、高压液相色谱仪、色谱柱、紫外检测分析仪。2.本专利技术所需材料为灵芝(Ganoderma lucidum(Fr.)Karst)子实体；甲醇和醋酸为色谱纯试剂；三氯甲烷、碳酸氢钠等为分析纯试剂；0.45μm微孔滤膜。3.本专利技术所指测量对象为灵芝(Ganoderma lucidum(Fr.) Karst)子实体中的三萜类化合物，具有以下一些特征 A.其外观为淡黄色固体结晶。B.色谱特征薄层色谱条件GF-254硅胶板，展开剂V(n-C6H14)∶V(CH2Cl2)∶V(CHCl3)∶V(MeOH)＝4∶3∶2.5∶0.5。在波长254nm检测下，Rf值0.35～0.90。高压液相色谱条件检测波长250～260nm，谱带宽度16，参比波长360nm，谱带宽度100，甲醇溶解样品，浓度1mg/mL，进样量10μL，流速0.8mL/min，柱温40℃；流动相5％醋酸—甲醇60∶40。惠普-1100型高压液相色谱仪分析显示8个主要特征峰，相对保留时间α分别为0.78、0.88、0.92、1.00、1.12、1.27、1.48、1.61，8个主峰面积百分数在70％以上。C.光谱特征其甲醇、氯仿、饱和NaHCO3溶液的紫外可见光谱中，在250～260nm处均有一个最大吸收峰；其红外光谱中，在3400cm-1，1025cm-1有羟基吸收峰，1710cm-1出现六元环酮，2955cm-1出现CH3-C-基团，2922cm-1和2851cm-1出现-C-CH2-C-强的伸缩振动峰。D.化学结构有5种不同的母核结构，见附附图说明图1。图1显示了利用紫外分光光度法所检测到的灵芝中三萜类化合物的五种结构母核，属于高度氧化的羊毛甾烷类衍生物，按分子中所含碳原子数目可分为C30、C27和C24三大类。在这五种基本骨架结构中，环上的双键大多位于Δ8(9)位，大部分在C11位和C23有羰基，而且在C3、C7、C15位也多被羰基或羟基所取代。而在三萜醇、醛和过氧化物的的结构中，环上大多存在二个不饱和双键、其位置在Δ7(8)、Δ9(11)位，C11位和C23位也不存在羰基，而且环上的取代基明显减少。4.标准品以及标准曲线的制备A.标准品的制备与检测结果。制备步骤大致为先按照文献方法从灵芝精粉中提取总三萜类化合物，再利用反复硅胶柱色谱方法分离，以氯仿∶甲醇＝98∶2，95∶5，50∶50梯度洗脱，收集98∶2洗脱出的馏分进行检测。薄层色谱检测选择展开剂V(n-C6H14)∶V(CH2Cl2)∶V(CHCl3)∶V(MeOH)＝4∶3∶2.5∶0.5，紫外检测分析仪(检测波长254nm)和硅胶板GF-254。选择检测结果呈现单一斑点的馏分进行高效液相色谱制备得到一种单峰物质。用分析型高效液相色谱进行检测，样品浓度1mg·mL-1，上样量10μL，流动相为5％醋酸-甲醇(60∶40)，流速1mL·min-1，检测波长250～260nm，参比波长360nm。检测结果为薄层色谱结果显示为单一斑点，Rf值为0.43。进一步用高压液相色谱分析，结果显示标准品纯度达100％，其保留时间为22.26min。其红外光谱中，在3400cm-1，1025cm-1有羟基吸收峰，1710cm-1出现六元环酮，2955cm-1出现CH3-C-基团，2922cm-1和2851cm-1出现-C-CH2-C-强的伸缩振动峰。B.标准曲线的制备方法与绘制精确称取三萜类化合物标准品，用饱和碳酸氢钠溶液配成起始浓度200μg·mL-1。充分溶解后，2倍稀释成系列浓度200、100、50、25、12.5μg·mL-1。以饱和碳酸氢钠溶液为空白进行基线调零，光谱扫描范围200～400nm，采样间隔0.5nm，光谱带宽2nm。确定最大吸收波长后，在此波长下进行标样的定量测定，计算线性回归方程并进行显著性检验。标准曲线绘制标准品系列浓度在200～400nm扫描波长范围内都有1个最大吸收峰，其最大吸收波长范围为250～260nm，线性回归方程为y＝-0.00574+0.01048x，相关系数r在0.9990～0.9999之间，SD＝0.01355，P＜0.0001(n＝6)。5.供试品制备方法根据附图2，精确称取0.2～2.0g灵芝供试品置于洁净的试管中，加入氯仿，振荡摇匀，浸泡0.5h～1h后于2000r·m-1离心，取样器准确吸取上清液得提取液I，余液放入分液漏斗中，用饱和NaHCO3萃取2～3次，收集氯仿层和NaHCO3层得提取液II和III。本专利技术的重点灵芝供试品中三萜类化合物含量快速检测的标准程序为精确称取0.2～2g灵芝子实体置于洁净试管中，加入氯仿浸提0.5～1h，氯仿体积ml数与样品重量g数之比为10∶1～20∶1。离心得上清液，用等量饱和NaHCO3溶液萃取2～3次，收集提取液III，即碱提的NaHCO3层为供试溶液，准确测量其体积后，稀释，运用紫外分光光度法在最大吸收波长250～260nm下测定供试溶液的光吸收值，根据标准曲线即可计算出样品中三萜类化合物的含量。本专利技术利用紫外分光光度法在提取三萜类化合物工艺的中间阶段，即碱提的NaHCO3层进行检测，省去了后面的酸化、氯仿萃取、减压蒸馏干燥等步骤，使得测定时间大大缩短。其中利用提取液III，即碱提的NaHCO3层来进行定量测定的原因为参照附图2的提取液制备流程，分别对供试品的3种提取液I、II、III中所含的三萜类化合物进行了紫外分光光度定量测定，多次实验结果表明提取液I和III的最大吸收波长是257nm，II则有两个峰值247nm和283nm。组份II虽然在257nm没有最大吸收，但吸收值也高达1.856，表明提取液I中非三萜类组份在257nm处也有较强的吸收，因此不能用来进行检测。含有三萜类组份的提取液III与标准品一样仅在257nm处有最大吸收，因此可以测定III中三萜类含量以代表样品中三萜类的含量。本专利技术的主要优点如下1.简本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨新林，黄书铭，朱鹤孙，徐建兰，
申请(专利权)人：北京理工大学，无锡市三联高科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：
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