一种测定制剂中神经生长因子含量的方法技术

一种测定制剂中神经生长因子含量的方法，其特征在于：该方法为凝胶色谱法，使用高效液相色谱仪检测，色谱条件为：　　　　（１）凝胶色谱柱：分子量检测范围为１０，０００～５００，０００道尔顿、孔径为２００～３００埃的凝胶柱；　　　　（２）流动相：ｐＨ值为６．５～７．２，浓度为０．０１Ｍ～０．０７Ｍ的磷酸盐缓冲液；　　　　（３）柱温：室温；　　　　（４）流速：０．６～１．０ｍｌ／ｍｉｎ；　　　　（５）检测波长：２０５～２２０ｎｍ。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，尤指凝胶色谱法测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方法。
技术介绍
神经生长因子(NGF)是神经系统最主要的活性成分之一，它能维持交感神经和感觉神经细胞的生存，影响中枢神经元的存活，促进神经细胞的分化，对保护神经系统的正常功能具有重要的作用，我国已经批准神经生长因子制剂作为药物销售和使用。现有的神经生长因子制剂中NGF的含量在4～30ug/ml，采用人血白蛋白作为保护剂，由于人血白蛋白与NGF同为蛋白质而且在制剂中的含量明显高于NGF，因而严重影响了NGF的准确定量。为了解决这个难题，人们尝试了多种检测方法，如Lowry法、紫外吸收法、Bradford法、和ELISA法等，但都因无法排除人血白蛋白干扰或受检测方法本身的灵敏度所限而失败。因此，目前我国NGF制剂生产厂家在产品检定过程中仍按照各自制定的标准执行，而缺少一种行之有效的国家标准，既不利于产品质量控制，更有碍于药品监督管理。有鉴于此，急需一种能够有效排除人血白蛋白保护剂干扰的测定制剂中神经生长因子含量的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种测定神经生长因子制剂中神经生长因子含量的方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案，该方法为凝胶色谱法，使用高效液相色谱仪检测，色谱条件为 (1)凝胶色谱柱分子量检测范围为10,000～500,000道尔顿、孔径为200～300埃的凝胶柱；(2)流动相pH值为6.5～7.2，浓度为0.01～0.07M的磷酸盐缓冲液；(3)柱温室温；(4)流速0.6～1.0ml/min；(5)检测波长205～220nm。使用高效液相色谱法中的凝胶色谱法对制剂中NGF的含量进行测定，其基本原理是通过流经色谱柱的各种物质的分子量的差异将其分离，分子量越大，保留时间越短。由于每种物质在一定条件下具有特定的保留时间，因此可通过色谱图上的保留时间获知目的峰的位置和相关参数，并通过该参数计算所得到的目的物质的含量。选用凝胶柱的最基本原则是其检测范围包含待检物质的分子量。NGF单体的分子量为13.6kD，其二聚体的分子量为26kD，故本专利选用了分子量检测范围在10,000～50,000道尔顿的凝胶柱作为分析用色谱柱。波长选取的标准与待检物质的光吸收性质有关，对一种蛋白质或多肽来讲，其最大吸收波长是固定的。通过紫外扫描，发现NGF在205～220nm波长均有光吸收，可作为检测波长。所述凝胶色谱柱选自TSK G3000 SW XL，7.8×300，5μ，(TOSOH，日本)、SHODEXProtein KW-804(SHODEX，日本)和BSA-7(MN，德国)，Phenomenex K3(Phenomenex，美国)中的一种。这些柱子的分子量范围均在10,000～500,000道尔顿，孔径为200～300埃。通过实验，摸索出本专利技术的较佳实施方案，其中流动相的pH值为7.0，流速为0.6～1.0ml/min，检测波长为214nm。以上凝胶色谱法可以使用标准曲线法或外标法对制剂进行测定。所述的标准曲线法包括如下步骤(1)作标准曲线取含量已知的NGF纯品为标准品，梯度稀释，以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，得到标准曲线；(2)测定NGF含量将待测制剂溶液以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，并将NGF对应的相关参数代入标准曲线得到其含量值。所述外标法包括如下步骤(1)作标准曲线取含量已知的NGF纯品为标准品，梯度稀释，以磷酸缓冲液为流动相，过凝胶色谱柱，在检测波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，得到标准曲线和线性范围；(2)外标法测定NGF含量在线性范围内选择合适的浓度，配制对照溶液和样品溶液，在选定的色谱条件下进行测定，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，即得。本专利技术的优点是凝胶色谱法特异性强、重复性好、自动化程度高，可有效排除制剂中包括人血白蛋白在内的辅料的干扰，对NGF定量准确。附图说明图1-1为制定标准曲线时NGF含量为0.02mg/ml时HPLC图谱；图1-2为制定标准曲线时NGF含量为0.04mg/ml时HPLC图谱；图1-3为制定标准曲线时NGF含量为0.06mg/ml时HPLC图谱；图1-4为制定标准曲线时NGF含量为0.08mg/ml时HPLC图谱；图1-5为制定标准曲线时NGF含量为0.10mg/ml时HPLC图谱；图2为流动相(PBS)的HPLC图谱；图3为白蛋白、甘露醇辅料溶液HPLC图谱；图4为含白蛋白、甘露醇等辅料的NGF制剂的HPLC图谱；图5为含氨基酸、表面活性剂、甘露醇等辅料的NGF制剂的HPLC图谱。具体实施例方式实施例1标准曲线法测定含人血白蛋白保护剂的NGF制剂中NGF的含量一、色谱条件仪器使用日本岛津Shimadzu LC-10Avp高效液相色谱仪；凝胶色谱柱TSK G3000 SW XL，7.8×300，5μ；流动相PBS(0.05M磷酸缓冲液，pH7.0)； 流速0.8ml/min；柱温室温；波长214nm。二、实验步骤1、作出标准曲线a、取含量已知的NGF纯品(取小鼠颌下腺，经离子交换层析和分子筛分离纯化出NGF，按《中国生物制品规程2000版》要求方法检验纯度＞98％)为标准品，加PBS将其梯度稀释成0.02、0.04、0.06、0.08和0.1mg/ml的溶液，摇匀；b、取各稀释点对照品溶液各20μl依次通过凝胶柱，以磷酸缓冲液为流动相，在214nm波长下检测，记录色谱图，获取保留时间、峰高、峰面积等参数，以浓度对峰面积进行线性回归，得到标准曲线和线性方程，计算回归系数；重复上述步骤以验证本方法重现性。如图1-1至图1-5所示，图谱上出现两个峰，依次为NGF的二聚体和单体，两种状态下的NGF都具有生物学活性。本专利技术以二聚体形式的NGF为目标检测物质，两次测定获得的各项参数见表1表1NGF标准曲线测定结果NGF浓度第1次测定 第2次测定(mg/ml)峰的编号保留时间峰面积峰的编号保留时间峰面积0.02 1 12.52 300501 12.50 314952 14.63 1623 2 14.62 13810.04 1 12.50 880411 12.48 901682 14.63 8248 2 14.62 46590.06 1 12.47 155716 1 12.47 1600302 14.62 5590 2 14.62 59780.08 1 12.47 228912 1 12.47 2267182 14.63 127932 14.63 77960.10 1 12.47 226718 1 12.45 2998122 14.63 7796 2 14.62 14354c、经计算得到两次回归方程分别为 (1)Y＝3×106X-34613，r＝0.9990(2)Y＝3×106X-39897，r＝0.9995Y为目的峰峰面积，X为样品浓度。2、测定NGF含量分别取流动相PBS、制剂中相应的辅料溶液(含0.1％白蛋白、6.0％甘露醇的水溶液)各20μl依次通过上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李月娟，刘蕴秀，冯宇霞，赵春文，
申请(专利权)人：北京三诺佳邑生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：