BRAF基因全外显子二代测序多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR-打断控制系统技术方案

本发明专利技术提供一种用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR‑打断控制系统。所述用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物包括SEQ ID NO：01至SEQ ID NO：36所示的引物。本发明专利技术提供的所述用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR‑打断控制系统，解决了以下现有的技术问题:1.现有技术主要检测BRAF基因的点突变，检测范围有限；2.实时荧光定量PCR检测、基因芯片只能检测已知位点；3.Sanger测序检验长度小于800bp的范围；4.不能检测低频突变；5.检测多个位点时操作繁琐、费用高。

【技术实现步骤摘要】
BRAF基因全外显子二代测序多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR-打断控制系统
本专利技术涉及基因检测领域，具体涉及一种用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR-打断控制系统。
技术介绍
BRAF（B-raf）基因编码是一种属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的蛋白质，是RAS/RAF/MEK/ERK/MAP信号传导通路中重要的转导因子，参与调控MAPKinse/ERK信号传导途径，从而影响诸如细胞生长、分化和凋亡等。研究表明，BRAF基因也是重要致癌基因之—，在多种人类恶性肿瘤中，如恶性黑色素瘤、结直肠癌（CRC）、非小细胞肺癌（NSCLC）、甲状腺癌、肝癌、胰腺癌以及毛细胞性白血病等，均检出不同比例的BRAF基因突变。BRAF基因的转录本NM_001354609.1全长2342bp，有18个外显子，已知最常见的突变形式主要是外显子15上第1860位（编码序列的第1799位）及附近的不同形式的点突变，导致第600位缬氨酸V突变为其他种氨基酸（谷氨酸E、天冬氨酸D、赖氨酸K、甲硫氨酸M、丙氨酸A），对于其他位点的研究较少。现有技术的BRAF基因突变检测多为针对BRAF基因的外显子15上第1860位点进行检测，存在以下局限性：1.实时荧光定量PCR检测和基因芯片检测，不能检测未知位点；2.Sanger测序的检测位点局限在800bp以内；3.不能检测低频突变；4.涉及多个位点检测时，原有技术操作繁琐、费用高。专利“一种基于下一代测序技术检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变位点的多重PCR引物和方法及应用”，解决的是同时检测EGFR/KRAS/BRAF基因突变的问题，针对于BARF，仍然只检测了外显子15上第1860位（编码序列的第1799位）的突变。
技术实现思路
为解决现有技术的的BRAF基因突变检测多为针对BRAF基因的外显子15上第1860位点进行检测，存在多种局限性的技术问题，本专利技术提供一种解决上述问题的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物、试剂及多重PCR-打断控制系统。用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物包括SEQIDNO：01~SEQIDNO：46所示的全部引物。用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂包括上述的多重PCR引物组合物以及多重PCR-打断测序所需试剂。引物组合物先用多重PCR扩增目的片段、凝胶电泳对PCR产物进行质控后，调整打断程序，将PCR产物打断至适合IonProton测序仪后，再进行后续实验。用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统包括：检测模块，采用上文所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂进行多重PCR-打断的二代测序；显示模块，将检测结果转换为可视化数据，并将可视化的数据于显示设备进行展示；分析模块：基于预设的质控程序对检测结果进行验证，并将验证结果于同一显示设备进行展示。其中，运行所述检测模块包括以下步骤：步骤一：多重PCR扩增目的片段；步骤二：凝胶电泳，对PCR产物进行质控；步骤三：将PCR产物打断至适合IonProton测序仪的程度；步骤四：文库构件，包括PCR产物纯化、末端修复、接头连接、片段筛选、文库PCR扩增、文库扩增产物纯化；步骤五：测定DNA产物浓度；步骤六：将扩增子碱基数*给定的深度，按计算结果将样品混合后稀释到上机浓度；步骤七：油包水扩增、末班序列富集；步骤八：基于IonProton测序仪进行测序，获得检测结果。所述显示模块将步骤八中的检测结果转化为包括“7号染色体概图”、“测序结果”、“参考序列”三项数据的图表。所述分析模块直接以所述显示模块转化得到的图表为原始数据，与预设的数据进行对比，并向所述显示模块输出检测结果。相较于现有技术，通过采用本专利技术提供的所述用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，基于二代测序的平台，利用靶向扩增技术进行多重PCR，打断仪将PCR产物打断至合适的片段长度，实现了对BRAF基因的全外显子二代测序，具有以下优点：1.能够100%覆盖BRAF基因的全外显子区域，能够全面、准确的检测待测样本BRAF基因的突变情况；2.能够检测出Sanger测序、实时荧光定量PCR、基因芯片所不能检测出的低频突变，具有较高的学术价值，能更好地服务于临床。在本专利技术中，引物序列的选择和打断，均经过了大量的实验和设计优化，最终形成了现有的引物组合。通过先扩增出目的片段，再用打断仪将PCR产物打断至合适的片段长度，使其处于最适合于进行后续的IonProton测序仪的状态。附图说明图1是多重PCR‐打断法BRAF二代测序结果概图；图2是多重PCR‐打断法BRAF二代测序结果细节图。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，所描述的实施例仅是本专利技术的一部分实施例，而不是全部的实施例。实施例1：用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物包括SEQIDNO：01~SEQIDNO：36所示的全部引物。将36条引物按照每管100p的标准稀释，取一个新的1.5ml离心管，将每种引物分别加入2ul，补水至总体积为200ul。维持引物的终浓度是1pmol，震荡混匀，-20℃保存备用。用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂包括上述引物组合物及多重PCR-打断测序所需的试剂，具体的内容在以下用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断测序方法中说明。用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统为采用上述的试剂对BRAF基因全外显子进行二代测序，包括以下步骤：1、多重PCR扩增，包括：1.1、提供PCR扩增体系：加入引物组合物5ul，及缓冲液等其他试剂。1.2、进行PCR扩增程序：2、凝胶电泳。3、PCR产物纯化：从50ulPCR反应体系中加入90ulAgencourtAMPureXPbeads，混匀，室温孵育5min；置于磁力架上2min，弃上清；加入150.0ul80%乙醇，静置30s，弃上清；加入150.0ul80%乙醇，静置30s，弃上清；室温放置10min，待磁珠干燥；加入27.0ulddH2O，重悬磁珠；室温静置2min，磁力架上放置2min；转移25.0ul上清至新的EP管/96孔板中。4、打断程序：5、打断产物纯化：以1.8X的磁珠比例（磁珠：产物=90:50）进行混合，置于磁力架上，待吸附磁珠后用80%乙醇进行清洗，待乙醇干燥后加入40ulH20进行洗脱。6、末端修复，包括：6.1、提供末端修复体系：6.2、PCR反应：6.3、纯化：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，其特征在于：包括SEQID NO：01至 SEQ ID NO：36所示的引物。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，其特征在于：包括SEQIDNO：01至SEQIDNO：36所示的引物。


2.一种用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂，其特征在于：包括权利要求1所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物及打断、二代测序所需试剂。


3.根据权利要求1或2所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR引物组合物，其特征在于：
所述多重PCR引物组合物通过如下处理方法获得：
先用多重PCR扩增目的片段、凝胶电泳对PCR产物进行质控后，调整打断程序，将PCR产物打断至适合测序仪后，再进行后续实验。


4.一种用于BRAF基因全外显子二代测序的多重PCR-打断控制系统，其特征在于，包括：
检测模块，采用权利要求2所述的用于BRAF基因全外显子二代测序的试剂进行多重PCR-打断的二代测序；
显示模块，将检测结果转换为可视化数据，并将可视化的数据于显示设备进行展示；
分析模块：基于预设的质控程序对检测结果进行验证，并将验证结果于同一显示设备进行展示。


5.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：代冰，程柳柳，周鹏涛，彭千，周梅华，
申请(专利权)人：长沙金域医学检验实验室有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43