含可变肽表位的免疫原制剂及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种利用一次合成制备免疫原肽混合物的方法。该肽混合物综合体现了病原体的免疫原表位的体内可变性。该混合物被称为高可变表位构建体（ＨＥＣ）。用ＨＥＣ进行免疫能够激发抗ＨＥＣ所基于的该病原体的各种株的广泛免疫反应性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种免疫原制剂及其制备方法，尤其涉及基于所选氨基酸制备免疫原肽混合物的方法，所述氨基酸选自蛋白表位的可变残基处出现的氨基酸。
技术介绍
很多病原体，包括病毒，如HIV-1和HIV-2、流感、肝炎A/B/C、人类乳头状瘤(HPV)、和登革热，以及寄生虫，如疟疾和旋毛虫，都易于改变尤其是蛋白表位中的氨基酸序列。鉴于这种行为以及其它目的，越来越多地探索将合成肽疫苗作为减活或灭活疫苗的可供选择物。选择具有有效免疫力的表位，而对于产生有害免疫应答的表位，如促进疾病形成或抑制T-细胞，都应该被排除在候选疫苗范围以外。此外，由于合成肽疫苗是通过化学设计，不含任何感染性物质，对身体危害很小。最后，减活疫苗需要在限定的冷却温度下运输和储存，与活的减活疫苗不同，合成肽疫苗相对稳定，且无须冷冻，因此更易于分配，成本也低。通常，合成肽疫苗具有抗细菌、抗寄生虫和抗病毒疫苗。细菌表位疫苗包括直接抗霍乱和Shigella的疫苗。抗霍乱的合成疫苗已经进行了人类I期和II期临床实验。流感和乙肝病毒代表两个病毒体系，其中合成疫苗看起来更具前景，最近人们又对抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的合成疫苗产生了兴趣。尽管目前进展很快，但合成肽疫苗还是不能跟上包膜蛋白或表面蛋白的变异速度。之前，有几个研究小组采用了几种方法试图克服表位变异。Tam在U.S.Patent number 5,229,490(July 20，1993)中描述了一种克服表位变异的方法。该方法涉及利用赖氨酸功能基和甘氨酸连接体将几个相似或不同的表位聚合成一种免疫原核(称为树枝状聚合物)。该方法被称为多抗原肽体系(MAPS)。然而高免疫原的、基于HIV的MAPS没有证明能诱导产生能识别各种病毒株的广泛反应性抗体(Nardelli et al.(1992)J Immunol 148914-920)。另一种早期方法涉及识别模拟簇(mimotopes)，随机产生模拟抗原表位的序列(Lenstra et al.(1992)J Immunol Methods 152149-157)。利用该方法，退化的寡核苷酸被嵌入细菌的表达载体上，导致形成长为6-8个氨基酸的随机肽库。利用感染了相应病原体的动物或人的血清(含有抗体)鉴定模仿抗原表位的肽。这种方法的确已经用于鉴定被感染了HCV的个体的血清所识别出的模拟簇(Prezzi et al.(1996)J Immunol 1564504-4513)。然而，这些肽是被随机选出的，因此，有必要获得并分析感染主体的血清，以制备模拟簇组合物。现有技术的方法的另一个缺点是，需要来自感染个体的血清，而很多感染个体并没有产生适宜的抗病原抗体。因此，利用患者血清来选择肽，很有可能会由于感染个体没能产生免疫应答，而导致漏掉重要的模拟表位抗原肽。利用SIV感染人类HIV的恒河短尾猴模型，已经描述了SIV包膜糖蛋白B细胞neutralization以及T细胞表位，并且基于高可变性和高抗原性表位SIVMACL42包膜糖蛋白(GPL30)设计并合成了合成免疫原(Anderson et al.(1994)Vaccine 12736-740)。该合成免疫原由肽的混合物组成，这些肽体现了SIV包膜基因序列中发现的氨基酸替代物的变异体。因此，合成免疫原综合表达了所发现的该具体表位的所有体内变化。通过测定该合成免疫原的免疫性，其显示了能诱导接受免疫的恒河短尾猴体内与天然SIV结合的抗体数量的增加。而且，该合成免疫原还促进对多种表位类似物的免疫反应性。在此文献以及以后的文献中都揭示了这种方法能够适应表位的可变性(Meyer et al(1998)AIDS Res Human Retro 14751-760)。最近的研究渐渐澄清了T细胞识别肽抗原的能力显得退化了。该发现使得人们更加注意一些外来抗原的肽能够模拟一些自身抗原并导致自身反应性T细胞的反应和自身免疫性疾病的形成。随后，就存在用随机合成肽的混合物免疫动物或人类而引起自身免疫性疾病的危险。模拟簇方法(LENSTRA et al.(1992)J Immunol Methods 152149-157)利用被感染动物或人的血清从随机合成的肽混合物中选择一亚类肽，因此降低自身免疫性疾病发生的危险。然而，尽管合成免疫原制剂如现有技术中所描述的那些，可以包含超过8000个不同的肽抗原，但上述合成免疫原制剂(Anderson et al.(1994)Vaccine 12736-740；Meyer et al(1998)AIDS Res Human Retro 14751-760)并不包括全部随机肽混合物，因为这些肽是基于仅在部分合成反应步骤中加入一些约20个氨基酸的肽而合成。该方法获得的免疫原会激起大范围的免疫反应性，这种制剂过于复杂以致难于进行生化或免疫性定性，对人类进行免疫后会承受引起免疫性疾病的严重风险。而且，没有完全的组成分析，混合的肽组合物也不会得到管理部门的认可。对于含有成千上百种肽的混合肽组成，进行完全分析将是一个耗时、高成本的工作。很多前述的合成免疫原制剂，是由上万种肽所组成的。如果T细胞识别外来抗原的能力退化，则混合肽就会导致含有模拟自身抗原的肽的危险，这将会诱导产生病原性自身免疫性应答。而且，即使不是没有进行化学定义和定性分析的可能，但前述合成路线的复杂性会使得对相同组成的多个制剂的定义和定性工作带来困难。基于上述原因，需要一种涉及免疫原肽混合物的新方法，该方法会产生比现有技术所描述的复合制剂成份更简单的制剂，但仍保留最佳的免疫原性。利用这种方法，使制备的混合物能够进行分析以便人类使用。而且，还需要一种用于分析该制剂的检测方法，以保证合成反应中形成的混合物的统一性和抗原性。专利技术简述本专利技术的目的之一是减少或消除先前免疫原制剂或制备该制剂的方法的至少一种缺陷。本专利技术提供了一种制备肽混合物的方法，所述肽混合物体现了蛋白表位体内序列变体。由该方法所制备的肽混合物能激起广泛免疫反应性，该肽混合物可用于制备抗病原性微生物如病毒和寄生虫的疫苗、治疗剂和诊断试剂盒。该方法可被应用于病原微生物的多种表位中。本专利技术提供了一种制备肽混合物的方法，该肽混合物被称为高可变表位构建体(HEC)，所得肽混合物综合体现了免疫原表位中体内可见的可变性，但组成简单足以能进行分析。该混合物表现了表位中氨基酸替代的变化。用该肽混合物对人体进行免疫，T细胞和B细胞应答减弱，导致抗体的高滴度，该抗体与远相关的天然病原蛋白的结合增强。此外，这些抗体能够中和HEC所基于的多种病原株的感染。本专利技术的一个方案提供了一种制备免疫原肽混合物的方法，其包括步骤获得病原体免疫原表位序列，该免疫原表位序列具有共同的残基区域，和至少一种各序列互不相同的可变残基；测定在免疫原表位序列的可变残基处出现的不同氨基酸的频率；合成肽混合物，其包括至多约100个不同肽，每种肽都具有共同的残基区域和一种可变残基位点上的氨基酸，该氨基酸选自出现频率大于约10％-约30％阈频率的免疫原表位序列中可变残基处的氨基酸。本专利技术还提供一种制备免疫原肽混合物的方法，其包括步骤获得病原体免疫原表位序列，该免疫原表位序列具有共同的残基区域，和至少一种各序列互不相同的可变残基；测定在免疫原表位本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备免疫原肽混合物的方法，其包括步骤：获得病原体的免疫原表位序列，所述免疫原表位序列具有一共同残基区域和至少一种可变残基，该可变残基使所述序列各不相同；测定免疫原表位序列的可变残基处出现的不同氨基酸的频率；合成包含至多约１００种不同肽的肽混合物，每种肽具有一共同残基区域和至少一种处于可变残基处的氨基酸，该氨基酸选自在免疫原表位序列的可变残基处出现频率大于约１０％至约３０％的阈频率的氨基酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：若泽V托里斯，
申请(专利权)人：变异生物技术公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]