一种抗人凋亡素２配体的单克隆抗体，其特征在于该抗体有以下几种应用： （１）人凋亡素２配体其相关分子的的鉴定； （２）人凋亡素２配体及相关分子的纯化； （３）人凋亡素２配体及相关分子制品的定量。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及抗人凋亡素2配体(human apoptosis 2 ligand，简称hApo-2L)的单克隆抗体的制备及应用，是利用细胞工程、抗体工程技术，获得分泌抗hApo-2L的单克隆抗体的细胞系，通过同品系的小鼠诱导腹水，制备抗hApo-2L的单克隆抗体；再通过蛋白质纯化、电泳、免疫等技术实现对该抗体的应用。属于生物工程领域。
技术介绍
目前，抗癌药物以化学合成和植物提取物为多，其疗效均不能达到完全有效的控制癌细胞的转移和扩散的水平，而且副作用普遍较大。hApo-2L，是由Wiley等于1995年首次发现并克隆成功的一种凋亡激活因子，是继TNF、FasL之后发现的第三个TNF家族成员，又称肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(TNF relatedapoptosis-inducing ligand，简称TRAIL)。与其他的TNF家族成员一样，hApo-2L也能诱导肿瘤细胞发生凋亡，而且具有自身的优点，如抑瘤的有效性hApo-2L单独使用，就可以有效诱导肿瘤细胞的凋亡；抑瘤的广谱性研究证实，hApo-2L可诱导近2/3现有的细胞系发生细胞凋亡，其中包括肝癌、乳腺癌、宫颈癌、前列腺癌、结肠癌、淋巴癌及肾脏肿瘤和中枢神经系统肿瘤等；低的毒副作用体外实验证实，hApo-2L对人脐静脉血管内皮细胞、肺成纤维细胞、乳腺细胞、肾脏细胞、前列腺细胞、结肠平滑肌细胞、星状细胞等均无诱导凋亡的作用；另外hApo-2L还可以与化疗药物协同用药。综上所述，hApo-2L由于具有高效、广谱、低毒等优点而有望成为一种新的抗肿瘤药物，因此受到广泛关注。但迄今为止，hApo-2L研究和开发进展较慢，本专利技术提供一种抗hApo-2L的单克隆抗体的制备方法，用该方法制备的单克隆抗体可用于hApo-2L及相关分子的鉴定、纯化以及hApo-2L及相关分子制品的定量等，以推动hApo-2L及相关分子的研究和开发。本专利技术用到杂交瘤细胞技术。该技术将骨髓瘤细胞与B淋巴细胞融合，以建立能分泌均质抗体的杂交瘤细胞系为目的，也称为单克隆抗体制备技术。该技术涉及到动物免疫、细胞培养、细胞融合、细胞克隆培养和免疫测定等一系列方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种抗hApo-2L的单克隆抗体，并阐明其制备和应用方法。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案 1、抗hApo-2L的单克隆抗体的制备方法，该方法包括以下步骤(1)动物的免疫选择适龄的小鼠，以经过适当纯化的抗原免疫。一段时间之后通过采血检测抗体效价。选择效价较高的小鼠留待融合。(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养以适当的培养液培养骨髓瘤细胞并使之保持良好的状态以利于细胞融合。(3)细胞融合将(1)中备好的小鼠处死，取出脾脏，释放B淋巴细胞。洗涤，此即为待融合的脾淋巴细胞。收集(2)中备好的细胞，洗涤，此即为待融合的骨髓瘤细胞。将上述两种细胞混合离心，然后以PEG介导融合。融合后的细胞适当稀释，种板，适当条件培养。(4)杂交瘤细胞的筛选将上述培养物进行选择培养。在细胞集落长到合适大小时，吸取培养液上清做抗体鉴定，筛选阳性克隆。(5)杂交瘤细胞的克隆以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种96孔板，尽可能使每孔只有一个细胞生长。形成集落的孔取上清做ELISA，鉴定阳性克隆。可以重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养做抗体鉴定。(6)小鼠腹水的诱导选择与杂交瘤细胞同源同系的小鼠诱导腹水。取到腹水以后，离心，上清留待纯化单克隆抗体。(7)单克隆抗体的纯化利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水上清中的单克隆抗体。2、抗hApo-2L的单克隆抗体应用，该应用方法主要表现在以下几个方面(1)hApo-2L及相关分子的鉴定，其鉴定方法可以通过下述两种途径实现一、用电泳技术，通过Western方法，进行hApo-2L及相关分子的鉴定；二、利用中和实验进行hApo-2L及相关分子的鉴定。(2)hApo-2L及相关分子的纯化购得CNBr-activated Sepharose 4B干胶，根据产品说明书，制备亲和柱，用以hApo-2L及相关分子的纯化。(3)hApo-2L及相关分子制品的定量通过标记抗hApo-2L的单克隆抗体，利用ELISA方法，进行hApo-2L及相关分子制品的定量。本专利技术的优点在于提供一种简便易行的方法制备和纯化hApo-2L的单克隆抗体，更为重要的是该方法制备的单克隆抗体可以有多种用途，如hApo-2L及相关分子的鉴定、纯化以及hApo-2L及相关分子制品的定量等。具体实施例方式实施例1、抗hApo-2L的单克隆抗体的制备方法(1)动物的免疫将纯化抗原和佐剂充分混合，然后选6～12周龄的BALB/c小鼠若干，每只经背部或腹部皮下多点注射抗原5～10ug；2～4周后抗原减半，再次依上次方法免疫小鼠；1周后，把经两次免疫后的小鼠尾部或眼球采血测抗体效价。选择效价高的小鼠休息2～3周，准备融和。融和前三天，经腹腔注射加强免疫一次。(2)小鼠骨髓瘤细胞的培养把来自BALB/c小鼠的SP2/0细胞株以DMEM培养基传代培养，一般两天传代一次。培养条件为37℃、5％CO2、饱和湿度。融合前一天传代以保证融合时进入对数生长期。(3)细胞融合将(1)中备好的小鼠处死，取出脾脏，置200目不锈钢筛网中，剔除脂肪和结缔组织，撕开包膜，释放B淋巴细胞，使细胞进入含基础培养液的培养皿内。以基础培养液离心洗涤此细胞1～2次，再以基础培养液混悬。此即为待融合的脾淋巴细胞。收集(2)中备好的细胞，离心弃上清，并用基础培养液洗涤2次。再以基础培养液混悬。此即为待融合的SP2/0细胞。将上述两种细胞悬液以一定比例混合离心，37℃水浴下往细胞中逐滴加入PEG溶液，1～2分钟后加入完全培养液终止反应，离心弃上清。然后以完全培养液悬起并适当稀释，种入96孔板，置37℃、5％CO2、饱和湿度下培养。(4)杂交瘤细胞的筛选将上述96孔板于融合后2～12小时加入HAT选择培养液。以后每隔几天以HAT培养液置换孔中一定比例的培养液。这种选择性培养大约持续两周。在细胞集落长到适当大小时，吸取培养液上清做ELISA，筛选阳性克隆。(5)杂交瘤细胞的克隆以有限稀释法克隆杂交瘤细胞，将稀释到一定密度的细胞接种96孔板，尽可能使每孔只有一个细胞生长。形成集落的孔取上清做ELISA，鉴定阳性克隆。可以重复克隆若干次，直到杂交瘤细胞的阳性孔率达到100％。将克隆化后的杂交瘤细胞扩大培养，上清做抗体鉴定。(6)小鼠腹水的诱导选择与杂交瘤细胞同源同系的BALB/c小鼠，经腹腔注入降植烷或无菌石蜡油，每只小鼠0.5ml；一周后，将处于对数生长期的杂交瘤细胞离心弃上清，以生理盐水重悬，调节细胞密度至107个/ml左右，注入小鼠腹腔，每只0.5ml。一周以后，小鼠腹部增大，即为产生的腹水。可以用粗针头扎入腹腔抽取，隔日一次，直至小鼠死亡；也可以直接处死小鼠一次性收集。离心，上清留待纯化单克隆抗体。(7)单克隆抗体的纯化利用辛酸-硫酸铵沉淀法纯化腹水上清中的单克隆抗体。将腹水上清中加入1～5倍体积的10～100mM的醋酸缓冲液；搅拌下，每毫升腹水上清加入10～500μl辛酸，室温放置一段时间或4℃较长时间放置，高本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：牛晓霞，刘金毅，孙俭波，程永庆，
申请(专利权)人：北京三元基因工程有限公司，北京毕艾欧科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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