绘制并消除T细胞表位的方法技术

本发明专利技术提供了用于确定蛋白质分子上可引起免疫反应的决定簇和表位的筛选方法。具体而言，本发明专利技术涉及在治疗性蛋白质中鉴定Ｔ细胞表位。最后，本发明专利技术涉及这样的组合方法，所述组合方法将使用表位绘制与由所述表位绘制法确定ＭＨＣⅡ类配体并分别设计具有此类配体和表位的数量减少的序列类似物相一致。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫学领域。本专利技术提供了筛选蛋白质分子上可引起免疫反应的决定簇和表位的方法。具体而言，本专利技术涉及在治疗性蛋白质中鉴定T细胞表位。最后，本专利技术涉及这样的组合方法，所述组合方法将使用表位绘制与由所述表位绘制法确定MHC II类配体并分别设计具有此类配体和表位的数量减少的序列类似物相一致。
技术介绍
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用。对于单克隆抗体，已开发了多种技术以试图减弱HAMA应答。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多情况下，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答。抗体不是唯一一类作为治疗剂施用的可引起免疫应答的多肽分子。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫应答。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)51353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)3181409-1413)。在这些人蛋白具有免疫原性的情况下，可能发生了对这些蛋白的免疫耐受的破坏，否则对这些蛋白的免疫耐受将在这些受试者体内运行。当人蛋白被作为替代治疗，例如在蛋白的组成性缺乏如血友病A、血友病B、高歇氏病(Gauchers disease)和许多其他疾病的遗传性疾病中，情况就不同了。在这些情况下，治疗学替代蛋白可能一开始就作为外来分子而产生免疫应答，并且当个体能够产生针对该治疗剂的免疫应答时，该治疗的功效将大打折扣。不管该蛋白治疗剂被宿主免疫系统视作外来分子还是本来存在的对该分子的耐受被克服了，对该蛋白的免疫反应的机理是相同的。诱导免疫应答的主要因素是在蛋白中存在可经由MHC II类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。此类T-细胞表位通常定义为任何能够与MHC II类分子结合的氨基酸残基序列。隐含地，″T-细胞表位″是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过与TCR相互作用而激活这些T-细胞以促进T-细胞应答。MHC II类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用。人群中的每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫应答的能力方面有最大的灵活性。针对治疗性蛋白的免疫应答通过MHC II类肽呈递途径进行。其间外来蛋白经吞噬和加工后与DR、DQ或DP型MHC II类分子结合以进行呈递。MHC II类分子由专门抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞等表达。通过MHC II类肽复合体与T细胞表面的关联性T-细胞受体的相互作用，及与某些其他共受体，如CD4分子的交联结合可诱导T-细胞进入激活状态。上述激活作用可导致细胞因子释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞产生抗体或激活T杀伤细胞形成完整的细胞免疫应答。T细胞表位鉴定是消除表位的第一步，然而，本领域中少有将表位鉴定和表位去除整合为一个方案的清楚的例子。因此，WO98/52976和WO00/34317中公开了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threadingapproaches)。这些教导中，利用目的蛋白中合理的氨基酸置换除去预测的T细胞表位。然而，在该方案和其他基于计算的表位鉴定方法中，预测的能够结合MHC II类分子的肽可能不会在所有情况下(尤其是在体内由于加工途径或其他现象)都起T细胞表位的作用。此外，对T细胞表位预测的计算方法通常不能预测DP或DQ限制性表位。同样，例如用明确定义的MHC同种异型的B细胞系作为MHC II类结合表面的来源以测量合成肽结合MHC II类分子的能力的体外方法可以应用于MHC II类配体的鉴定。然而，这些技术不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位，也不能确定结合肽能够起T细胞表位的作用。最近利用重组MHC分子与合成肽的可溶性复合体的技术已经得到应用。这些试剂和方法用于鉴定人或实验动物受试者的外周血样中能结合特定MHC-肽复合物的T细胞克隆的存在，但是这些试剂和方法不适于筛选各种MHC同种异型的多种潜在表位。T细胞活化的生物学测定提供了一个解读受试肽/蛋白序列引起免疫应答的能力的实用选择。该类方法的例子包括Petra等人用对细菌蛋白葡萄球菌激酶的T细胞增殖进行测定，然后用合成肽刺激T细胞系的表位作图。类似地，使用破伤风毒素蛋白的合成肽进行T细胞增殖测定导致明确了该毒素免疫显性的表位区。WO99/53038公开了一种方法，该方法利用分离的人免疫细胞亚型，促进它们的体外分化，在合成的目的肽存在时培养细胞，并测定培养的T细胞中任何诱导的增殖来确定受试蛋白的T细胞表位。同样的技术也被Stickler等人描述过，在这两个例子中，该方法都用于检测细菌枯草杆菌蛋白酶的T细胞表位。这种技术需要小心应用细胞分离技术和补充多种细胞因子的细胞培养基以得到所需的免疫细胞亚型(树突状细胞、CD4+和/或CD8+T细胞)，并且无助于使用多种供体样品的快通量筛选。在这些方法的一种改变形式中，Hiemstra等描述了鉴定可刺激已知T细胞的肽表位的方法，此方法对于在(自身)抗原未知的情况下检测其自身反应性T细胞克隆是极有价值的。有许多上述例子和其他涉及测定体外T细胞活化事件(通常通过测定诱导的增殖反应进行)的改变形式的生物学试验。但是，这些方法无一提供了用于检测人源蛋白质中生物学相关表位的统一方案，也不易用于检测大量MHC同种异型中重要的表位。本专利技术用于提供此种方案，并提供了用于对特定的原则上有治疗价值但最初为免疫原性肽、多肽或蛋白质进行鉴定和去除T细胞表位的基础。总之，本专利技术涉及下述内容·在幼稚T细胞试验中使用一组合成肽绘制治疗蛋白质的免疫原性区，特别是治疗蛋白质为人蛋白质；·在回忆试验中使用一组合成肽精细绘制治疗蛋白质的免疫原性区；·在幼稚T细胞试验中使用一组完整蛋白质的变体以选择体外显示最小免疫原性的变体；·在幼稚T细胞试验中使用一组合成肽变体以选择体外显示最小免疫原性的肽序列；·使用T细胞刺激的生物学试验以选择在幼稚T细胞试验中刺激指数小于2.0、优选小于1.8的肽序列；·使用T细胞刺激的生物学试验以选择在幼稚T细胞试验中刺激指数小于2.0、优选小于1.8的蛋白质变体本文档来自技高网...

【技术保护点】
使用外周血单核细胞（ＰＢＭＣｓ）对受试蛋白质或其片段构建Ｔ细胞表位图谱的方法，其包括下列步骤：（ｉ）使用完整受试蛋白质或合成肽进行体外抗原接触，其中所述合成肽为代表性的并产生自所述受试蛋白质或其片段的氨基酸序列，通过将合成肽与来自ＰＢＭＣ的Ｔ细胞孵育并培养；（ｉｉ）用细胞因子处理并培养已接触抗原的Ｔ细胞；（ｉｉｉ）将已接触抗原的Ｔ细胞加至自体的经照射ＰＢＭＣｓ，并进行与所述合成肽抗原的新一轮接触和培养，以及（ｉｖ）通过事先选择的时程法在Ｔ细胞增殖试验中测定Ｔ细胞反应。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M贝克，FJ卡尔，G卡特，
申请(专利权)人：默克专利有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]