芡实叶子的乙醇提取物的制备方法及其应用技术

芡实叶子的乙醇提取物的制备方法及其应用，涉及蜜蜂的蜜蜂美洲幼虫病防治技术领域。将阴干的芡实叶子研磨成粉末后采用乙醇水溶液浸泡，经抽滤，取滤液旋转蒸发，取得芡实叶子的乙醇提取物。将该提取物溶解于二甲基亚砜中，用于防治蜜蜂美洲幼虫病。该提取物的使用不存在停药期，在蜂群的整个生产及繁殖阶段均可安全使用，有助于维护蜂群的健康，促进蜂群整体生产力的提高。

【技术实现步骤摘要】
芡实叶子的乙醇提取物的制备方法及其应用
本专利技术涉及蜜蜂的蜜蜂美洲幼虫病防治

技术介绍
蜜蜂是重要的经济昆虫，蜜蜂是传花授粉媒介的重要组成部分,是构成全球生物多样性的重要组成成分,它们对作物、水果和野生植物的授粉活动，使其成为世界范围内最重要的传花授粉昆虫之一，不仅对于农业生产意义重大，更是在维系生物多样性中扮演着重要角色。同时，蜜蜂生产的蜂蜜、蜂花粉、蜂王浆、蜂胶等蜜蜂产品也是重要的保健食品和化工原料。美洲幼虫病(AmericanFoulbrood，AFB，又称美洲幼虫腐臭病、美洲幼虫腐烂病)，简称美腐病，是一种恶性的蜜蜂幼虫传染病，在世界范围内均有发生。美洲幼虫病与幼虫芽孢杆菌感染有关，该病的发生与幼虫的抵抗力有很大的关系，主要是通过已经感染的蜜蜂饲喂蜂群幼虫，使得该病迅速在蜂群的幼虫间快速传播。通常现代的处置方式是在蜂群确诊该病后需要就地焚烧处理，防止疾病扩散。AFB的病原是幼虫芽孢杆菌(Paenibacilluslarvae)，属于一种革兰氏阳性细菌。蜜蜂幼虫对幼虫芽孢杆菌的敏感性随着日龄的增长而降低，在每个感染的幼虫体内能产生数以亿计的、具有感染能力的孢子，由于其孢子对热和化学物质有极强的抵抗力，可存活长达35年之久，导致AFB感染后，幼虫残骸的鳞片、蜂箱、产品和设备都是潜在的污染源。目前用于治疗AFB的抗生素很多，如磺胺类药物、盐酸土霉素、四环素、青霉素、链霉素、红霉素、卡那霉素、红霉素、泰乐霉素等，药物通常配用糖浆或者蜜水，勾兑后喷施。每次糖浆和蜜水用量，每脾用100-150mL，间隔4-5d喷施1次。但是，连续使用抗生素有污染蜂产品的可能。为此，用药用量要控制得当，尤其要避开生产季节，防治抗生素在蜂产品中的残留。而且，尽量选择早春或晚秋，治疗效果则会更好些。然而，总体来看，抗生素会在蜂产品中残留，严重影响蜂产品的质量，给人类的健康造成威胁。除此之外，抗生素还会使蜜蜂病原体的耐药性增强，导致病原体产生相应的变异，使得蜂群患病更加严重。可见，通过使用抗生素对AFB进行防控，往往因超量使用，或者使用抗生素时间不当很容易造成蜂产品中抗生素残留超标，抗生素只能抑制临床症状并不能对孢子发挥作用，且接触了抗生素的幼虫和成蜂，其寿命明显缩短，更严重的是耐药性的产生是导致其对AFB已无法有效地控制主要原因，在全世界范围内给养蜂者造成了巨大的经济损失，与此同时也直接影响了人们食品安全问题。为了减少养蜂生产中抗生素的使用，人们采用植物进行蜂病的防治。如山西振兴鱼蜂药业公司的纯中药制剂-毒螨菌一次净、甘肃天水汇涛蜂业公司的中草药植物粉剂-健蜂抗螨香粉、山西卫鹏制药有限公司的中草药制剂-蜂康等。不过，目前这些治疗蜂病的产品从种类和疗效上都不能较好满足绿色蜂业的发展需要。还有通过拮抗性细菌发挥生物防控作用，如EvansandArmstrong首次成功地利用培养的P.larvae对幼虫芽孢杆菌引起的AFB进行了生物防控；日本研发的原露技术，对防治蜂病，特别是爬蜂病、大肚病、幼虫病和蜜蜂痢疾等有明显的预防效果，不过其作用谱窄、药效慢、持效短、且易受外界条件的影响。目前在全世界范围蜜蜂的种群数量逐年递减，在引起蜜蜂种群锐减的诸多因素中，病原体对抗生素产生耐药性，是导致蜂群疾病防控失败的主要原因。随着抗生素类药物的长期使用，蜂群耐药性病菌不断出现，药物抗性问题日显突出，而因为药效逐渐降低、抗生素的用量又不断加大，由此形成了一个恶性循环。
技术实现思路
本专利技术目的在于提出一种天然的、能够替代抗生素的植物源的用于防治蜜蜂美洲幼虫病的芡实叶子的乙醇提取物。本专利技术芡实叶子的乙醇提取物的制备方法是：将阴干的芡实叶子研磨成粉末后采用乙醇水溶液浸泡，经抽滤，取滤液旋转蒸发，取得芡实叶子的乙醇提取物。所述芡实叶子的乙醇提取物的含水量为10～20wt.％。所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分数为75～85％。本专利技术工艺简单，经试验证实其对蜜蜂幼虫芽孢杆菌具有抑制效果。本专利技术另一目的是提出上述制备方法取得的芡实叶子的乙醇提取物的应用。将所述芡实叶子乙醇提取物溶解于二甲基亚砜中，用于防治蜜蜂美洲幼虫病。经试验证实，不同的芡实叶子乙醇提取物都对蜜蜂幼虫芽孢杆菌具有抑制效果，这为开发防治AFB提供了天然药物及饲料奠定了基础，同时也为绿色养蜂生产寻找出新型的、天然的、能够替代抗生素的植物源制剂。更优越的是芡实叶子乙醇提取物的使用不存在停药期，在蜂群的整个生产及繁殖阶段均可安全使用，有助于维护蜂群的健康，促进蜂群整体生产力的提高。植物源抗生素替代制剂可减少抗生素的使用、降低蜂产品中抗生素的残留，提高蜂产品的产量和质量。附图说明图1为菌落PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。图2为芡实叶子提取物的抑菌效果图。具体实施方式1、材料与方法：1.1实验材料1.1.1实验样本的采集蜜蜂的成虫及幼虫采集于当地转地放蜂的蜂场，在已经有临床症状的蜂群中，取成年有临床症状的蜜蜂及有临床症状的幼虫分别放入无菌的指型管中，置于冰上。同时，收取来自同一蜂场看起来是健康的蜂箱及巢脾的成年蜜蜂及幼虫带回，并置于-70℃冷冻保存。1.1.2芡实叶子提取物的制备将采集来的阴干的芡实叶子研磨，分别称取20g粉末，按照1:20的质量比例分别用体积百分数为75～85％的乙醇水溶液浸泡2h后抽滤，再将抽滤后的粉末继续浸泡24h后再抽滤，如此反复3、4次，合并各抽滤所得的滤液，利用旋转蒸发仪减压浓缩至粘稠状，即得芡实叶子乙醇提取物。经检测取得的芡实叶子乙醇提取物的含水量为10～20wt.％。1.1.3实验试剂的配置制备Luria-Bertani液体培养基：将酵母抽提物1g、胰化蛋白胨0.5g和氯化钠0.5g混合后，采用缓冲液调整pH值至7.2，加入适量双蒸水定容到100mL，高压灭菌，降温，取得Luria-Bertani液体培养基。制备蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉：将25％蜂王浆、50％雄蜂蛹粉、15％蛋白粉和10％蜂王幼虫粉混合，合计100％，经冷冻干燥，取得蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉。将蜜蜂幼虫芽孢杆菌的培养粉分包装、密封后置于-20-20℃保存。1.1.4实验仪器南京优普环保设备有限公司出品的制水机；METTLERTOLEDO电子天平；SHELLAB水浴锅；5834R型冷冻离心机；TelstarLyoQuest冻干机；GHX9160B-1培养箱；超低温冰箱；SW-CJ-2HD超净工作台。1.2.实验方法1.2.1蜜蜂样本的处理取自已经发病蜂群的幼虫采用PBS(幼虫和PBS的混合比为10g∶100ml)匀浆得悬浮液，然后在80℃下加热10min或95-96℃加热3-5min。将已经发病蜂场的成年蜜蜂用PBS充分荡洗，所得到的样品分为三份，每份分别进行三种处理：不经加热处理；在80℃下热处理10min；在95℃下热处理3min。将已经发病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.芡实叶子的乙醇提取物的制备方法，其特征在于：将阴干的芡实叶子研磨成粉末后采用乙醇水溶液浸泡，经抽滤，取滤液旋转蒸发，取得芡实叶子的乙醇提取物。/n

【技术特征摘要】
1.芡实叶子的乙醇提取物的制备方法，其特征在于：将阴干的芡实叶子研磨成粉末后采用乙醇水溶液浸泡，经抽滤，取滤液旋转蒸发，取得芡实叶子的乙醇提取物。


2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述芡实叶子的乙醇提取物的含水量为10～20wt.%。

【专利技术属性】
技术研发人员：叶满红，周斌，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32