ATP生物发光法在快速评估消毒剂消杀效果的应用制造技术

本发明专利技术涉及ＡＴＰ生物发光法在快速评估消毒剂消杀效果的应用，首先根据消毒剂消毒效果评估时主要采用的标准菌株制作标准菌悬液，用细胞ＡＴＰ释放剂Ｅｃ进行处理后加入荧光素酶－荧光素试剂，检测发光值（ＣＰＭ）。同法，将标准菌悬液用消毒剂作用后采用ＡＴＰ清除剂结合微孔滤膜过滤，检测滤膜发光值（ＣＰＭ）。同时作系列标准ＡＴＰ浓度及对应的ＣＰＭ值取对数后的线性回归方程，再利用标准菌株ＡＴＰ含量与细胞数量的换算系数（Ｋ）求出消毒剂处理前后的标准微生物菌悬液的活菌数量，评估消毒剂的消杀效果。利用本发明专利技术评估一种消毒剂的消毒效果仅需要１～３ｈ，极大提高了评估的效率，大幅度缩短了评估时间，而且有效地克服了非目标细胞ＡＴＰ对测定的干扰。

【技术实现步骤摘要】
专利说明ATP生物发光法在快速评估消毒剂消杀效果的应用 本专利技术涉及快速评估消毒剂消杀效果的方法及试剂，尤其涉及ATP生物发光法在快速评估消毒剂消杀效果的应用。按照“消毒与灭菌的评价方法与标准”(GB15981-1995)和2002年卫生部颁布的《消毒技术规范》，在评价或测试消毒剂杀灭微生物能力的试验中一般包括三个步骤。试验微生物先经消毒液处理，再中和去除消毒剂的作用，最后转到液体培养基中培养后观察浊度变化(定性)或转到固体培养基中培养后计数菌落(定量)，从而计算出杀菌效率。由于采用培养法计数，需用1～5天才能观察结果。这样采用常规方法评估一个消毒剂的杀菌效果需要一周以上的时间，且工作量非常大。因此建立新的快速评估方法是当前消毒剂行业的迫切要求。为了实现对消毒剂消毒效果的快速评估，Best等人尝试以五种不同类型的微生物混合液作为试验菌悬液，通过消毒剂对该混合液的杀菌谱来划分消毒剂类型，取得了较好的效果。郇政山报道了发酵法与快检纸片法在餐具检测中消毒效果的评价，此法以其快速、便捷的优点得以推广。细菌的快速培养定量方法如微滴菌落计数法以及用于实验室筛选消毒产品的微生物生长分析仪等皆有报道。这些快速评价方法有其实用的一面，然而这些都是通过培养法计数，改善的程度不大。ATP生物发光技术是目前有望实现即时检测微生物最快的方法，它的原理是萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)以荧光素(D-Luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O2为底物，在Mg2+存在时，能将化学能转化为光能。反应式表示为ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线性关系。D’Eustachio和Levin的研究表明，各生长时期的细菌均有较恒定水平的ATP含量，一般为每个细胞含ATP0.28×10-10～8.9×10-10μg(即0.054～1.76×10-18mol)，平均为3×10-10μg ATP/cell(0.594×10-18molATP/cell)，酵母细胞大约是细菌细胞的100倍，每个酵母细胞的ATP含量也比细菌细胞多100倍左右。因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测出ATP的含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅为几分钟。本专利技术的目的在于提供一种快速评估消毒剂消杀效果的方法及试剂。本专利技术所提供的ATP生物发光法在快速评估消毒剂消毒效果中的应用，主要是将ATP生物发光法这种微生物数量快速检测技术替换传统真菌和细菌的平板培养计数法，进行消毒剂处理前后的活菌数量快速测定。评估一种消毒剂的消毒效果仅需要1～3h，极大提高了评估的效率，大幅度缩短了评估时间。本专利技术最主要的技术特征是首次将ATP生物发光法这种微生物数量快速检测技术用于消毒剂消毒效果的评估；其次是采用ATP清除剂结合滤膜过滤的办法，有效地克服了非目标细胞ATP对测定的干扰。本专利技术按照GB15981，在消毒剂消毒效果评估中主要采用4种标准菌株大肠杆菌(Escherichia coli)8099、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)ATCC 6538、枯草杆菌黑色变种(Bacillus subtilis var.niger)ATCC 9372和白色念珠菌(Candidaalbicans)ATCC 10231。具体操作方法如下(1)标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)测定a.制备4种标准指示菌株菌悬液在37℃下，用胰蛋白胨(TSA)培养基培养大肠杆菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372标准菌株18～24h，用沙堡弱氏琼脂培养基培养ATCC 10231菌株40～48h，通过接种针刮下斜面上的菌苔，用生理盐水制成菌悬液，经8000r/min室温下离心5min，弃上清后的菌泥用生盐水悬浮，使细菌指示菌的数量为1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的数量为1×107～5×107cells/mL，作为测试用的标准菌悬液(简称A液)。b.菌悬液的活菌含量平板培养计数按10倍稀释法进行倾注平板培养计数，培养和计数方法按GB15981。c.标准菌悬液的生物发光法测定获得上述4种标准菌株8099、ATCC 9372、ATCC 6538和ATCC10231菌悬液(A液)后，用ATP提取剂Ec对4种菌悬液以及作为空白对照的生理盐水和用生理盐水配制的一系列标准ATP溶液在室温下进行ATP提取1～5min，取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑剂的检测缓冲液中，加上萤光素酶-荧光素试剂0.1mL通过生物发光仪检测每分钟发光值(CPM)。d.标准菌株ATP含量与细胞数量的换算系数(K)测定通过对系列标准ATP浓度及其对应CPM值取对数后，进行线性回归，获得线性回归方程Lg(mol/L)＝A+B×Lg(CPM)。然后将标准菌悬液测得的CPM值代入回归方程，求出其ATP浓度，再通过与平板培养计数结果对照，可获得各标准菌株的ATP含量--细胞数量换算系数K。ATP含量--细胞数量换算系数K＝悬液平板计数菌数(cfu/mL)×103/菌悬液的ATP浓度(mol/L)。(2)消毒剂处理后生物发光法对照值测定采用目的消毒剂处理指示菌悬液，以平板法验证，达到100％杀灭指示菌株，将处理液用微孔滤膜过滤并用ATP清除剂进一步去除非目的ATP的干扰，提取残留细胞中的ATP后进行发光检测，并用系列标准ATP和配制ATP的无菌纯水进行同样的ATP提取的发光检测，通过系列标准ATP及其对应的CPM值取对数后的回归方程，换算成相当于原液中的ATP浓度，比较100％杀灭样品的ATP浓度和空白溶液中的ATP浓度，对不同类型的指示菌进行经验处理后，使100％杀灭样品经ATP生物发光换算成的活菌总数结果能较好地和平板培养结果相对应。(3)利用换算系数进行消毒剂消杀效果快速评估a.消毒效果初始评估用菌悬液的制备在37℃下用胰蛋白胨(TSA)培养基培养大肠杆菌8099、ATCC 6538、ATCC 9372标准菌株18～24h，用沙堡弱氏琼脂培养基培养ATCC 10231菌株40～48h，用接种针刮下斜面上的菌苔后，用生理盐水制成菌悬液。经8000r/min室温下离心5min，弃上清后的菌泥用生理盐水悬浮，通过血球计数板初步估计，使细菌指示菌的数量为1×108～5×108cells/mL，真菌指示菌的数量为1×107～5×107cells/mL，直接作为不加有机物的评估用菌液(简称A液)，加有机物的评估用菌液则将离心后的菌泥用生理盐水悬浮，再与30g/L的BSA(牛血清白蛋白)无菌溶液按1∶1比例混合后即成，(简称B液)。b.消毒处理前标准菌悬液活菌总数的ATP生物发光法测定取1mL评估用标准菌悬液，加入1mL细胞ATP提取剂Ec振匀，于室温作用适当时间(1-5min)，取0.1mL ATP提取溶液，加入0.8ml含解抑剂的pH7.8，为25mmol/L的Tricine缓冲液中，加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂，立即摇匀，置生物发光检测仪进行发光脉冲计数(发光CPM值)。进行空白和系列标准ATP的校正检测，并做出ATP和CPM的对数线性本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＡＴＰ生物发光法在快速评估消毒剂消杀效果的应用，其特征在于：首先制作标准菌悬液，用细胞ＡＴＰ释放剂Ｅｃ进行处理，加入萤光素酶－萤光素试剂后检测发光值（ＣＰＭ）；同法，将标准菌悬液用消毒剂作用后采用ＡＴＰ清除剂结合微孔滤膜过滤，检测滤膜发光值（ＣＰＭ），同时作系列标准ＡＴＰ浓度及对应的ＣＰＭ值取对数后的线性回归方程，再利用标准菌株ＡＴＰ含量与细胞数量的换算系数（Ｋ）求出消毒剂处理前后的标准微生物菌悬液的活菌数量，评估消毒剂的消杀效果。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴清平，吴慧清，张菊梅，李程思，
申请(专利权)人：广东省微生物研究所，广州环凯生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]